检测DNA点突变的探针、试剂盒及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113897418A(43)申请公布日2022.01.07(21)申请号202110721028.4(22)申请日2021.06.28(71)申请人华中科技大学地址430074湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号(72)发明人吴曈勃张珍胡鱼强(74)专利代理机构北京金智普华知识产权代理有限公司11401代理人蓝晓玉(51)Int.Cl.C12Q1/6827(2018.01)权利要求书1页说明书13页序列表11页附图8页(54)发明名称检测DNA点突变的探针、试剂盒及应用(57)摘要本发明涉及检测DNA点突变的探针、试剂盒及应用。该探针具有用于被核酸内切酶IV(EndoIV)酶切的AP位点，AP位点将所述探针分为第一序列和第二序列；探针可通过其部分序列分别与突变链和野生链互补形成第一底物和第二底物，第一底物和第二底物分别具有被核酸内切酶IV酶切形成具有第二序列的游离单链的第一活性和第二活性，第一活性大于第二活性。由于EndoIV对不同第一底物和第二底物这种截短的dsDNA结构具有独特的酶切活性，进而设计独特的EndoIV探针，使得其与目标链形成此种特殊的dsDNA结构，极大地降低了EndoIV的序列序列依赖性，扩宽了检测的普适性，降低了检测的成本。CN113897418ACN113897418A权利要求书1/1页1.一种检测DNA点突变的探针，用于区分DNA突变链和DNA野生链的探针，其特征在于，所述探针为一单核苷酸链，所述探针具有用于被核酸内切酶IV酶切的AP位点，所述AP位点将所述探针分为第一序列和第二序列；所述探针可通过其部分序列分别与突变链和野生链互补形成第一底物和第二底物，所述第二底物具有一错配的碱基位点，所述错配的碱基位点与所述突变链的突变位点相对应；所述第一底物和所述第二底物分别具有被核酸内切酶IV酶切形成具有所述第二序列的游离单链的第一活性和第二活性，所述第一活性大于所述第二活性。2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述第一底物具有第一双链序列，所述突变链的突变位点处于所述第一双链序列中，所述第二底物具有第二双链序列，所述错配的碱基位点处于所述第二双链序列中；所述第一双链序列和所述第二双链序列对应处在相同的序列位置。3.如权利要求2所述的探针，其特征在于，所述第一双链序列中，用于形成所述第一双链序列的所述突变链5’末端处在距离所述AP位点位于所述突变链的5’方向上游1个碱基至3’方向下游7个碱基之间。4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述第一双链序列中，用于形成所述第一双链序列的所述突变链5’末端处在距离所述AP位点位于所述突变链的3’方向下游1个碱基处。5.如权利要求3或4所述的探针，其特征在于，所述第一双链序列中，所述突变链的突变位点处在距离所述AP位点位于所述突变链的5’方向上游1～4个碱基处或3’方向下游1个碱基处。6.一种检测DNA点突变的探针，其特征在于，包括如权利要求1‑5任一项所述的探针，连接在所述探针的所述第一序列上所述AP位点5’方向上游的荧光基团及连接在所述探针的所述第二序列上所述AP位点3’方向下游的荧光猝灭基团。7.一种检测DNA点突变的探针，其特征在于，包括如权利要求1‑5任一项所述的探针，其中，所述探针的所述第二序列为脱氧核酶序列。8.用于DNA点突变检测的试剂盒或试剂组合，其特征在于，包括如权利要求6所述的探针及核酸内切酶IV。9.用于DNA点突变检测的试剂盒或试剂组合，其特征在于，包括如权利要求7所述的探针，核酸内切酶IV，纳米颗粒及辅助金属离子，所述纳米颗粒连接有标记荧光基团并用于被所述脱氧核酶切割的底物。10.权利要求1‑7任一项所述的探针、权利要求8‑9任一项所述的试剂盒或试剂组合在检测DNA点突变体中的应用。2CN113897418A说明书1/13页检测DNA点突变的探针、试剂盒及应用技术领域[0001]本发明涉及单核苷酸突变检测的技术领域，尤其涉及检测DNA点突变的探针、试剂盒及应用。背景技术[0002]单核苷酸变异(SNV)或其他类型的各种DNA点突变与多种人类疾病相关，而各种DNA点突变已被公认为可作为人类癌症临床诊断和治疗的生物标志物，如TP53、EGFR和RAS基因突变。然而，突变型DNA(MT)在临床样本中通常与大量野生型DNA(WT)共存，其丰度水平较低(<0.1％)。目前，已经开发出多种检测DNA点突变的方法，包括DNA测序、聚合酶链反应(PCR)和核酸杂交。DNA测序(Sanger测序，二代测序等)和PCR(等位基因特异性PCR，阻断PCR，液滴数字PCR等)是最常用的策略。然而，这两种策略都需要长的反应和检测时间、成本高、实验条件优化复杂，对仪器和操作人员提出了更高的