制备DNA探针的方法、试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107686837A(43)申请公布日2018.02.13(21)申请号201610629100.XC12Q1/689(2018.01)(22)申请日2016.08.03C12Q1/6806(2018.01)(71)申请人湖北生物医药产业技术研究院有限公司地址430075湖北省武汉市东湖高新技术开发区高新大道666号人福医药集团综合办公大楼申请人武汉珂美立德生物医药有限公司(72)发明人许勇周昌茂王学海黄璐马铮马梵辛肖强刘哲(74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙)11201代理人李志东(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图3页(54)发明名称制备DNA探针的方法、试剂盒及其应用(57)摘要本发明提出了制备DNA探针的方法、试剂盒、检测生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法以及确定生物制品生产工艺的方法。该制备DNA探针的方法包括：(1)将大肠杆菌细胞基因组DNA进行超声破碎处理，其中，在所述超声破碎处理中，所述大肠杆菌细胞基因组DNA的浓度为20微克/毫升；以及(2)将所述超声破碎处理的产物与标记试剂进行孵育处理，以便获得DNA探针，所述DNA探针携带所述标记。利用该方法所制备的DNA探针，能够特异、灵敏、快速、准确地检测生物制品(包括中间样品、半成品、成品)中大肠杆菌DNA的残留量。CN107686837ACN107686837A权利要求书1/2页1.一种制备DNA探针的方法，其特征在于，包括：(1)将大肠杆菌细胞基因组DNA进行超声破碎处理，其中，在所述超声破碎处理中，所述大肠杆菌细胞基因组DNA的浓度为20微克/毫升；以及(2)将所述超声破碎处理的产物与标记试剂进行孵育处理，以便获得DNA探针，所述DNA探针携带所述标记。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声破碎处理是在400W的条件下进行3h，任选地，所述标记为地高辛。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将0.32μg～0.64μg的所述超声破碎处理的产物与0.64ng～1.28ng所述地高辛进行孵育处理，任选地，所述地高辛来自DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitl中的Vial1试剂，任选地，基于0.32μg～0.64μg的所述超声破碎处理的产物，所述Vial1试剂的用量为4微升～8微升。4.一种制备DNA探针的方法，其特征在于，包括：1)将大肠杆菌细胞基因组DNA标准品用纯化水稀释至20μg/ml，用超声仪进行超声破碎处理，所述超声破碎处理是在400W的条件下进行3h，2)将经过超声破碎处理的基因组DNA置于100℃下水浴10min、冰浴10min，3)将来自DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitl中4μl～8μl的vial1试剂与16μl～32μl经过超声破碎处理的基因组DNA混合，并短暂离心，37℃水浴孵育过夜，4)加入2μl浓度为0.5M、pH为8.0的EDTA终止孵育反应，5)加入2.5μl浓度为3M、pH为5.2的醋酸钠和75μl预冷无水乙醇，-20℃放置2h以上，12000rpm的条件下离心15min，弃上清，6)加入500μl预冷的70％乙醇，12000rpm的条件下离心5min，弃上清，获得沉淀，7)室温晾干所述沉淀，并用50μlTE溶解沉淀，获得所述探针DNA，任选地，进一步包括将50μl所述探针DNA加入预热的3.5ml杂交液，所述杂交液来自Roche试剂盒，以便获得含有所述探针的杂交液。5.一种试剂盒，其特征在于，包含DNA探针，所述DNA探针是利用权利要求1～4任一项所述的方法制备的。6.一种检测生物制品中大肠杆菌DNA含量的方法，其特征在于，包括：1)将待测生物制品、大肠杆菌基因组DNA阳性对照样品进行变性和稀释处理，所述稀释处理是在鲑鱼精DNA稀释液中进行的；以及2)利用DNA探针检测生物制品中大肠杆菌的DNA含量，所述DNA探针是利用权利要求1～5任一项所述的方法制备的，任选地，所述鲑鱼精DNA稀释液是通过如下方式制备的：i)0.1g的鲑鱼精DNA溶于10ml的TE缓冲液，ii)将溶于TE缓冲液的鲑鱼精DNA进行剪切处理，iii)将经过剪切处理的鲑鱼精DNA进行200倍的稀释处理，所述稀释处理是在TE缓冲液2CN107686837A权利要求书2/2页中进行的，以便获得所述鲑鱼精DNA稀释液，任选地，所述剪切处理是通过如下方式实现的：利用7号针头将溶于TE缓冲液的鲑鱼精DNA进行反复抽打处理。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用DNA探针检测生物制品中大肠杆菌的DNA