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本发明公开了一种脱氧核糖核酸酶I活性检测方法,其步骤包括以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板,利用标准脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应,终止酶解反应,在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen,测定荧光值,绘制标准曲线;以小牛胸腺DNA或者环状双链DNA为模板,加入待测脱氧核糖核酸酶I进行酶解反应,终止酶解反应,在酶解产物中加入dsDNA定量试剂Picogreen,测定荧光值,根据上一步的标准曲线,计算待测脱氧核糖核酸酶I的酶活。本发明通过检测酶解产物的荧光信号来快速测定脱氧核糖核酸酶I的活性,无放射性污染,具有简便、快速、高灵敏等优点,可用于高通量、自动化的聚合酶活筛选。