一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105861641A(43)申请公布日2016.08.17(21)申请号201510035400.0(22)申请日2015.01.23(71)申请人珠海市丽珠单抗生物技术有限公司地址519020广东省珠海市金湾区红旗镇联港工业区双林片区创业北路38号C02楼西侧201室(72)发明人彭育才艾军文朱保国(74)专利代理机构北京泛华伟业知识产权代理有限公司11280代理人郭广迅李渤(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表2页附图2页(54)发明名称一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明提供了一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物对，采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计，同时提供了根据该核苷酸序列涉及的Taqman探针，以及相应的检测方法，所述方法为实时荧光定量PCR法，根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。本发明的检测方法可以用于检测以CHO细胞作为基因工程表达细胞株的生物蛋白，例如抗体、治疗性蛋白或疫苗等。本发明的实时荧光PCR检测CHO细胞DNA的方法和依据所述方法制备的PCR试剂盒，实现了检测CHO细胞DNA残留的定量限低至0.1fg/μl，表明本方法具有非常好的灵敏度，且具有较高的特异性。CN105861641ACN105861641A权利要求书1/1页1.一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物对，其特征在于，所述引物对为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的特异性引物；优选地，所述引物对为SEQIDNO:1所示的正向引物和SEQIDNO:2所示的反向引物。2.一种用于检测CHO细胞DNA残留的反应体系，其特征在于，所述反应体系为实时荧光定量PCR反应体系，包含如权利要求1所述的引物对。3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述体系还包括采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的Taqman探针；优选地，所述Taqman探针的序列SEQIDNO:3所示。4.如权利要求2或3所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR缓冲液和DNA模板；优选地，所述DNA模板为待测样品、阴性质控品或IPC。5.一种用于检测CHO细胞DNA残留的方法，其特征在于，所述方法为实时荧光定量PCR法，包括使用如权利要求1所述的引物对扩增序列的步骤；优选地，所述实时荧光定量PCR法使用如权利要求2或3所述的反应体系进行反应。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃1min，40个循环；根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法的检测样本为以CHO细胞作为基因工程表达细胞株的生物蛋白，优选地为抗体、治疗性蛋白或疫苗。8.一种用于检测CHO细胞DNA残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括PCR扩增反应液、标准品、阴性质控品、IPC以及DNA稀释液；其中，所述PCR扩增反应液包括Taq酶、dNTPs、Mg2+、PCR缓冲液、引物对以及Taqman探针；所述引物对为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的特异性引物；所述Taqman探针为采用GenBank登录号为J00052.1的核苷酸序列设计的Taqman探针。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为SEQIDNO:1所示的正向引物和SEQIDNO:2所示的反向引物。10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的序列如SEQIDNO:3所示。2CN105861641A说明书1/8页一种用于检测CHO细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种用于定量检测CHO细胞(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞)DNA含量的引物、试剂盒及检测方法。背景技术[0002]在现代，一大批生物蛋白如单抗类药物、重组蛋白类药物、疫苗等在临床上得到了广泛应用，生产这些生物蛋白的宿主细胞主要是细菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。因而在经过纯化得到的最终蛋白产品中会残留这些宿主细胞的DNA。DNA残留量虽然很低，但是蛋白产品中的残留DNA会对人体存在潜在的危险性。一般认为宿主细胞DNA中可能包含了某些未知的DNA片段，一些可能整合了病毒的DNA片段会使人体受到感染，还有一些带有癌变基因的DNA片段可能会诱发产生肿瘤。因此，让蛋白产品