检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109837345A(43)申请公布日2019.06.04(21)申请号201711191299.3C12N15/11(2006.01)(22)申请日2017.11.24(71)申请人中国食品药品检定研究院地址100050北京市东城区天坛西里2号申请人中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心湖州申科生物技术有限公司(72)发明人王兰武刚吴婉欣宗伟英朱冰美(74)专利代理机构上海一平知识产权代理有限公司31266代理人崔佳佳徐迅(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/686(2018.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图7页(54)发明名称检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法(57)摘要本发明提供了检测小鼠细胞，例如NS0或SP2/0细胞基因组DNA的引物对、包含该引物对的试剂盒以及利用该引物对检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于SEQIDNO:1所示序列。利用所述引物对的PCR检测方法操作不仅简便快捷、灵敏度高，还能区分真核宿主细胞，例如CHO细胞、Vero细胞，毕赤酵母菌、大鼠细胞，特别是人类的干扰性DNA以及原核宿主细胞，例如大肠杆菌的干扰性DNA。CN109837345ACN109837345A权利要求书1/1页1.一种检测小鼠细胞基因组DNA的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于小鼠细胞基因组DNA上SEQIDNO:1所示序列的第1821-1840位；其中的反向引物结合于SEQIDNO:1所示序列的第1900-1920位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为90-110bp。2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。3.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对。4.如权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述正向引物如SEQIDNO:2所示，所述反向引物如SEQIDNO:3所示。5.如权利要求3或4所述的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包含探针。6.一种检测小鼠细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：利用权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述的检测试剂，对待测样品进行PCR，并检测PCR扩增产物。7.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1或2所述的引物对。8.一种PCR方法，包括步骤：在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对扩增目标产物。9.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3-5中任一项所述的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在小鼠细胞DNA。2CN109837345A说明书1/9页检测小鼠细胞残留DNA的引物及方法技术领域[0001]本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及小鼠细胞，例如SP2/0或NS0细胞的残留DNA的检测引物及方法。背景技术[0002]在现代，生物重组制品，包括重组蛋白药物、基因重组疫苗、生物抗原抗体以及各种细胞因子等已广泛应用于医药健康领域，发挥着越来越重要的作用。国际上对其的质量控制和安全性检测都具有极其严格的要求。[0003]重组生物蛋白绝大多数由大规模的基因改造工程宿主细胞生产，细胞中复杂的非目标产物是终产物中主要的杂质来源，直接影响生物制品的安全性。其中残余的生物遗传物质DNA是一个非常重要的污染，因此，对它的检测是重要的质量控制环节。[0004]在重组生物蛋白制品中，残余DNA多来源于培养的宿主细胞。这些宿主细胞多为原核细胞、外源哺乳动物细胞以及肿瘤来源细胞。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质，都有可能传递与肿瘤或病毒相关的基因，并导致癌变或其它病理变化。当一定量的残留DNA与制品一同进入人体后，含有致癌基因的DNA片段就可能诱发肿瘤的产生；如果生物制品中含有某些可以整合病毒的DNA，则这种DNA通过表达后具备感染性，从而导致一系列的不良后果。[0005]关于生物制品中宿主细胞残余DNA的限量检测，过去比较普遍的采用分子杂交的半定量方法。该方法基于传统的分子基因杂交技术，需要的检测条件相对简单，检测限在10pg左右基本能够满足一些疫苗和治疗性生物制品的检测需求。但由于该方法存在时间长、操作繁琐、稳定性、敏感性、特异性较差等缺点，已经不能满足日益严苛的检测要求，在一些发达国家已经淘汰。[0006]Taqman探针检测属于实时定量PCR技术，是一种快速的高通量检测方法，它在PCR扩增过程中加入一个特异性的荧光探针，通过荧光信号的变化反映产物的增加情况，从而能够定量分析样本中的初始模板。近年来，由于Taqman探针技术在特异性、灵敏性、准确性