一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110305938A(43)申请公布日2019.10.08(21)申请号201810259308.6(22)申请日2018.03.27(71)申请人天士力生物医药股份有限公司地址201203上海市浦东新区中国（上海）自由贸易试验区居里路280号1、2幢(72)发明人徐丽娟袁婀娜陶铜静韩进(74)专利代理机构北京华科联合专利事务所(普通合伙)11130代理人王为(51)Int.Cl.C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书16页序列表6页附图8页(54)发明名称一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法(57)摘要本发明涉及一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法，本发明利用特异性引物对参与荧光定量PCR检测反应并检测生物制品中残留CHO细胞DNA。荧光定量PCR是通过荧光染料，对PCR产物进行标记跟踪，并计算待测样品模板的初始浓度，其中，所述特异性引物对，正向引物序列见SEQIDNO:15，反向引物序列见SEQIDNO:16。CN110305938ACN110305938A权利要求书1/1页1.一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对，包括正向引物和反向引物，其特征在于，其中正向引物结合于测试序列的第130-146位；其中反向引物结合于测试序列的第266-282位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为153bp。2.根据权利要求1的引物对，其特征在于，其中所述测试序列为与SEQIDNO:1所示序列有85％以上序列相似性的核苷酸序列。3.根据权利要求1的引物对，其特征在于，其中所述测试序列与SEQIDNO:1所示序列有98％的序列相似性。4.根据权利要求1的引物对，其特征在于，其中所述测试序列如SEQIDNO:4所示。5.根据权利要求1的引物对，其特征在于，其中所述正向引物选自：SEQIDNO:5/7/9/11/13/15/17/19/21/23，所述反向引物选自：SEQIDNO:6/8/10/12/14/16/18/20/22/24。6.根据权利要求1的引物对，其特征在于，其中正向引物如SEQIDNO:15所示，反向引物如SEQIDNO:16所示。7.权利要求1的引物对的筛选方法，其特征在于，步骤如下：A.通过NCBI网站，查询目标产物序列，设计引物对P，对目标产物进行PCR扩增；B.将扩增产物进行序列测定，获得测试序列；C.将测试序列与目标产物进行BLAST比对，确定序列相似性；D.设计若干引物对P’扩增测试序列；E.将扩增产物进行溶解曲线测试，筛选有特异性扩增峰，且无其他非特异性杂峰的引物对进行后续试验；F.将扩增产物进行扩增曲线及在不同退火温度下的Ct值测试，筛选出其中的Ct均值最低的引物对进行后续试验；G.将筛选出的引物对P’进行标准品线性测试，筛选线性结果优的引物对；其中所述步骤G包括如下步骤：(1)将目标产物标准品稀释若干个浓度点；(2)利用筛选得到的引物对目标产物标准品不同浓度点进行扩增，建立标准曲线及计算扩增效率；(3)筛选符合标准曲线R2≥0.98，且扩增效率(E)在90％～110％的浓度线性范围为10000pg/2μL～0.01pg/2μL的引物对P’。8.一种利用权利要求1的引物对定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的检测方法，其特征在于，利用所述引物对参与荧光定量PCR检测反应并检测生物制品中残留CHO细胞DNA的含量；其中荧光定量PCR是通过荧光染料，对PCR产物进行标记跟踪，计算待测样品模板的初始浓度。9.根据权利要求8的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR反应体系为总体积25μL，其中，2×浓度的荧光预混试剂12.5μL，正向引物(F，10μM/μL)1μL，反向引物(R，10μM/μL)1μL，H208.5μL，DNA模板2μL。10.根据权利要求8的检测方法，其特征在于，PCR检测的反应条件为：①预变性：95℃30sec；②荧光收集：95℃1min，52℃1min，72℃1min，扩增40个循环，每个循环结束后收集荧光信号；③溶解曲线分析：65℃逐步升至95℃，每隔0.5sec升高0.5℃，收集荧光信号。2CN110305938A说明书1/16页一种用于定量检测CHO宿主细胞DNA残留量的引物对及检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于定量检测CHO细胞(ChineseHamsterOvary，中国仓鼠卵巢细胞)DNA残留量的引物对及检测方法。背景技术[0002]CHO细胞为1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生