一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112094928A(43)申请公布日2020.12.18(21)申请号202011235318.X(22)申请日2020.11.09(71)申请人天津科佰迪生物医药科技有限公司地址300000天津市滨海新区洞庭路220号天津国际生物医药联合研究院实验楼N212第33单元(72)发明人陈涛王博玮李雅雯(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表2页附图2页(54)发明名称一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法(57)摘要本发明公开了一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法，本发明利用实时荧光定量PCR技术进行定性和定量检测昆虫细胞DNA残留的方法和依据所述方法制备的PCR试剂盒，实现了检测昆虫细胞DNA残留的定量限低至3fg/ul，表明本方法具有很好的灵敏度和特异性。本发明提供的实时荧光定量PCR方法可以检测基于以昆虫细胞为表达宿主细胞进行生产的重组蛋白或重组病毒类疫苗或基因治疗载体等，例如：重组腺相关病毒等，可为基因治疗载体的研发和安全生产提供可靠的质量检测数据。CN112094928ACN112094928A权利要求书1/1页1.一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下所述：正向引物序列：5’-CGCTGTAAGAGGACCGTAG-3’，反向引物序列：5’-GACCTCACGCAATCTTCTGA-3’。2.一种用于检测昆虫细胞DNA残留的试剂盒，其特征在于：包括2×TaqmanMasterMix、标准品、DNA稀释液和引物探针混合物；所述引物探针混合物包括引物对和Taqman探针，其中引物对的核苷酸序列如下所述：正向引物序列：5’-CGCTGTAAGAGGACCGTAG-3’；反向引物序列：5’-GACCTCACGCAATCTTCTGA-3’；Taqman探针的核苷酸序列如下所述：Taqman探针：5’-ACCGCTGCCTCCTCCTGCAGG-3’；Taqman探针的5’端标记有荧光报告基团，其荧光报告基团为FAM，3’端标记有淬灭基团，其淬灭基团为MGB。3.如权利要求2所述的一种用于检测昆虫细胞DNA残留的试剂盒，其特征在于：所述2×TaqmanMasterMix包含Taq酶、dNTPs、Mg2+、BSA、UNG酶和PCR反应缓冲液。4.如权利要求2所述的一种用于检测昆虫细胞DNA残留的试剂盒，其特征在于：所述标准品为昆虫细胞基因组DNA。5.一种用于检测昆虫细胞DNA残留的方法，其特征在于：采用实时荧光定量PCR法，其反应程序为:50℃2min，95℃预变性10min；95℃10sec，60℃1min，45个循环；根据所得标准曲线，计算待检样本中昆虫细胞DNA残留量。6.如权利要求5所述的一种用于检测昆虫细胞DNA残留的方法，其特征在于：所述方法的检测样本为以昆虫细胞为表达宿主细胞进行生产的重组蛋白或重组病毒类疫苗或基因治疗载体。2CN112094928A说明书1/7页一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测昆虫细胞DNA残留的引物、试剂盒及检测方法。[0002]背景技术[0003]实时荧光PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够周期性地发出特定波长的激发光从而激发产生激发光，然后CCD收集激发光的信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。TaqManPCR技术是实时荧光PCR的一种。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光基团发出的荧光被淬灭基团淬灭，呈现淬灭效应。随着扩增反应的进行，Taq酶的5’端外切酶活性将与检测靶标偶连的探针从5’端开始水解，从而释放出荧光基团产生荧光信号。随着扩增反应的进行，荧光信号呈现出指数级的增长。[0004]与传统的分子杂交方法相比，TaqManPCR技术具有如下优点：1、通过对扩增曲线以及对数增长期的循环阈值（Ct）的分析，能够对待测样品进行准确定量分析，从而有效监测纯化工艺的效果；2、将DNA扩增与检测过程融合为一体，可以实时监测DNA扩增的全过程，省掉了分子杂交后处理过程，大大缩短了结果分析时间，具有方便、快捷、高效的优点；3、检测过程采用封闭检测的模式，大大减少气溶胶污染和由此造成的假阳性的问题；4、与普通的染料qPCR相比，TaqManPCR增加了一条可与模板互补配对的荧光探针，有效结合了普通染料qP