一种高效提取人大量粪便样本DNA提取方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112695028A(43)申请公布日2021.04.23(21)申请号202110209955.8(22)申请日2021.02.25(71)申请人苏州易迈吉生物医药科技有限公司地址215143江苏省苏州市相城区黄埭镇安民路6号(72)发明人贾萌萌潘韵芝朱国强(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种高效提取人大量粪便样本DNA提取方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种大量提取转化粪便DNA的方法。现有技术很繁琐而且耗时，且由于粪便样本中成分复杂，提取的DNA由于含量少，不稳定，对粪便DNA分子诊断的准确性造成干扰。本发明中的裂解液能够充分裂解粪便样本，并彻底去除粪便中的抑制下游PCR反应的成；并且操作简便快速，所得DNA纯度与浓度符合要求，磁珠的应用可大大提高实验通量，可用于粪便DNA提取的自动化应用，可以充分满足下游检测实验的要求，尤其是高灵敏度检测项目的需求，填补了商品化试剂盒和现有方法的空白。CN112695028ACN112695028A权利要求书1/1页1.一种人类大量粪便样本DNA高效提取试剂盒，其特征在于：由以下四种溶液组成：(1)粪便细胞裂解液：为醋酸钠、硫酸铵、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)和NaCl的混合溶液，混合溶液中醋酸钠的浓度为50‑500mM之间，优选浓度为200mM；CTAB的质量浓度为0.1‑1%之间，优选质量浓度为0.2‑0.5%之间；NaCl的浓度为20‑600mM之间，优选浓度为50‑200mM之间；硫酸铵的浓度为200‑950mM之间，优选浓度为350‑450mM之间；(2)杂质沉淀剂：为曲拉通X‑100和硫酸氢铵的混合溶液，其中，曲拉通X‑100体积比浓度为0.5‑3%之间，优选体积比浓度为1‑2%之间；硫酸氢铵的浓度为500‑1500mM之间，优选浓度为800‑1000mM之间；(3)DNA结合液：为NaCl、乙酸钾和异丙醇的混合溶液，其中，NaCl的浓度为500mM‑2M之间，优选浓度为1‑2M之间；异丙醇体积浓度为10‑30%之间，优选浓度为15‑20%之间，乙酸钾的浓度为500mM‑2M之间，优选浓度为1‑1.5M之间，用醋酸调溶液的pH值为4‑5之间，优选PH为4.5；(4)蛋白杂质去除液：为硫酸铵和盐酸胍的混合溶液，其中，硫酸铵的浓度为300mM‑2M之间，优选浓度为205‑450mM之间；盐酸胍的浓度为2M‑4M之间，优选浓度为2.5M；(5)DNA漂洗液：为NaCl和乙醇的混合物，其中，乙醇的浓度为65‑85vt%之间，优选浓度为75‑80vt%之间；NaCl的浓度为20‑200mM之间，优选浓度为50‑100mM之间；(6)DNA洗脱液：5mM的Tris‑HCl缓冲液，pH值8.0‑8.5。2.一种通过权利要求1所述的人类粪便DNA提取的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)称取人粪便样本2‑5g于15‑50mLEP管中，加入5mL粪便细胞裂解液，在漩涡振荡器上振荡2min；(2)70℃孵育10min，孵育期间震荡2‑3次；(3)12,000rpm离心3min；取上清液至新的15‑50mLEP管中；(4)将步骤(3)获得的上清液中加入500µL杂质沉淀剂，在漩涡振荡器上振荡2min；12,000rpm离心3min；(5)将步骤(4)获得的上清液转移4mL到新的EP管中，加入4mLDNA结合液和2mL乙醇和100µL磁珠溶液，振荡混匀，室温放置5min；(6)将(5)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管取下磁力架，加入2mL蛋白杂质去除液，涡旋振荡混匀；(7)将(6)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管取下磁力架，加入2mLDNA漂洗液，涡旋振荡混匀；(8)将(7)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管取下磁力架，加入500µLDNA漂洗液，涡旋振荡混匀；(9)将(8)中的溶液转移到1.5‑2mLEP管，置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，磁力架上放置5min；将EP管取下磁力架，加入200μLDNA洗脱液，静置2min，涡旋振荡混匀；(10)将(9)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪吸取全部上清，磁珠弃去。2CN112695028A说明书1/4页一种高效提取人大量粪便样本DNA提取方法及试剂盒技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，涉及自非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体涉及一种大量人类粪便DNA