一种新型基因克隆T‑载体及其构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106399348A(43)申请公布日2017.02.15(21)申请号201610944866.7(22)申请日2016.10.26(71)申请人南京师范大学地址210023江苏省南京市文苑路1号(72)发明人尚广东陈中秋(74)专利代理机构南京知识律师事务所32207代理人卢亚丽(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表4页附图2页(54)发明名称一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用。具体为将两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因克隆至pBluescriptII(KS-)，分别获得pLS3417和pLS3424，宿主菌为大肠杆菌DB3.1，XcmI酶切去除ccdB基因后获得T-载体。T-载体设计为通过保留T和A两个碱基而保持lacZα读码框结构，以提供α-互补的功能。TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物和T-载体相连后，转化大肠杆菌DH10B，在含氨苄青霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的筛选平板上，含有自连载体的菌株呈现篮斑，而含重组克隆的菌株为白斑，以此筛选得到重组克隆。CN106399348ACN106399348A权利要求书1/1页1.一种新型基因克隆T-载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将序列如SEQIDNO.13或SEQIDNO.14的两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因分别克隆至pBluescriptII(KS-)，分别获得pLS3417和pLS3424，宿主菌为大肠杆菌DB3.1；XcmI酶切去除ccdB基因后获得T-载体。2.一种新型基因克隆T-载体，其特征在于通过下述方法构建得到：将序列如SEQIDNO.13SEQIDNO.13或SEQIDNO.14的两侧含XcmI酶切位点的ccdB基因分别克隆至pBluescriptII(KS-)，分别获得pLS3417和pLS3424，克隆宿主菌为大肠杆菌DB3.1；XcmI酶切去除ccdB基因后获得T-载体。3.权利要求2所述新型基因克隆T-载体的应用，是以Taq聚合酶扩增的PCR产物和T-载体相连后，转化大肠杆菌DH10B，在含氨苄青霉素、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷和5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的筛选平板上，含有自连载体的菌株呈现篮斑，而含重组克隆的菌株为白斑，以此筛选得到重组克隆。2CN106399348A说明书1/7页一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种新型基因克隆T-载体及其构建方法和应用。背景技术[0002]基因克隆为分子生物学实验的一个常规步骤，是基因功能和蛋白功能研究的基础。克隆PCR产物是基因克隆的主要部分，基因方法有多种，如T-载体法、PCR产物和载体均酶切的方法、USERcloning和ligase-independentcloning等。其中T-载体法由于其简便、快捷和高效等因素而最为常用。[0003]T-载体克隆PCR产物以蓝白斑筛选来区分重组克隆和载体的自连。基于大肠杆菌半乳糖苷酶(LacZ)的α-互补蓝白斑筛选的基本原理如下。构建重组克隆的宿主菌如大肠杆菌DH10B和DH5α等基因组上的β-半乳糖苷酶N端31个氨基酸缺失，而克隆载体如pBluescriptKSII(-)等的多克隆位点的一段核苷酸序列可编码如SEQIDNO.9所示的含有相应的31个氨基酸的短肽(LQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEE)。pBluescriptKSII(-)转化至大肠杆菌DH10B后，两者的半乳糖苷酶基因部分互相补充而形成具完整功能的β-半乳糖苷酶。在培养基中含有IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)时，IPTG诱导β-半乳糖苷酶高表达，酶切X-gal得到生色团而形成蓝色菌落。而当外源基因克隆至pBluescriptKSII(-)的多克隆位点后，几乎不可避免地造成读码框的改变而不能表达能互补的31个氨基酸，进而不能获得有功能的β-半乳糖苷酶，X-gal不被酶切，含重组质粒的菌株不变色，呈现白色。挑取白斑来培养、提质粒、酶切和测序即可鉴定出重组克隆。[0004]线性化的T-载体在其双链DNA的克隆位点分别含有5'-3'链的T碱基(此即T-载体的名称由来)以及3'-5'链的A碱基。由Taq扩增的PCR产物含有3'-A的突出端，在T4DNA连接酶的作用下，PCR产物和T-载体通过A-T碱基的相互连接而实现PCR产物的克隆。[0005]常用的商业化T-载体为美国Promega