TrPPA基因及其克隆、表达载体构建方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109306356A(43)申请公布日2019.02.05(21)申请号201810977115.4A01H5/00(2018.01)(22)申请日2018.08.26A01H6/20(2018.01)(71)申请人四川农业大学地址611130四川省成都市温江区惠民路211号(72)发明人彭燕章有知雍斌张艳李州张新全马啸(74)专利代理机构成都点睛专利代理事务所(普通合伙)51232代理人李玉兴(51)Int.Cl.C12N15/55(2006.01)C12N9/14(2006.01)C12N15/10(2006.01)C12N15/82(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表2页附图5页(54)发明名称TrPPA基因及其克隆、表达载体构建方法和应用(57)摘要本发明公开了提供一种能够提高白花三叶草生长过程中对低温、高温、盐胁迫和干旱的抗逆能力，同时可以提高其生物量的TrPPA基因。该TrPPA基因的cDNA全长序列如序列表1所示。通过荧光定量PCR验证了TrPPA在低温，高温，盐胁迫、干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在低温，高温，盐胁迫、干旱胁迫下，TrPPA基因在根与叶中的表达量均发生了显著的变化，各胁迫条件及时间点下有所差异，能够有效提高白花三叶草生长过程中对低温、高温、盐胁迫和干旱的抗逆能力，将TrPPA基因通过基因工程的手段转入到拟南芥中，转基因植株较野生型生长速度更快，叶片更大型，同时株高和植株鲜重、干重生长量显著提高，说明TrPPA具有促进植物生长的作用。适合在生物技术领域推广运用。CN109306356ACN109306356A权利要求书1/2页1.TrPPA基因，其特征在于：所述TrPPA基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCEIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的TrPPA基因，其特征在于：所述TrPPA基因编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQUENCEIDNO.2所示。3.TrPPA基因的克隆方法，其特征在于包括以下步骤：1)、材料选择：选取白花三叶草种子，将选取的种子经75％酒精和1％次氯酸钠消毒后用Hoagland全营养液水培于光照培养箱中12h光照(23℃)，12h无光(19℃)，相对湿度75％，光照强度250umol·m-2·s-1，培养30d；2)、白花三叶草总RNA的提取：首先，取步骤1)得到的白花三叶草叶片，然后采用RNAprepPure植物总RNA提取试剂盒提取白花三叶草叶的RNA；3)、cDNA的合成；首先，在微型管中配制反应混合液，随后42℃反应2min，冰上迅速冷却，所述反应混合液体系如表1所示：表1反应混合液体系表接着，在另一微型管中配制反转录反应液总量为20μL，缓慢混匀后采用PrimeScriptTMIII1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒进行反转录反应，反应过程如下：先在37℃下反应15min后，再85℃5sec，冰上冷却，所述反转录反应液体系如表2所示：表2反转录反应液表4)、扩增：使用MaxDNAPolymerase进行PCR反应，所述PCR反应体系如表3所示：表3PCR反应体系表2CN109306356A权利要求书2/2页PCR反应过程如下：(1)94.0℃，5.0min；(2)98.0℃，10.0sec；55.0℃，5.0sec；72.0℃，5.0sec；共35cycles；(3)72.0℃，10.0min；PCR反应引物为：Forwardprimer(5'--3'):ATGGCTCCACCAATTGAGACCC；Reversedprimer(5'--3'):CTACCGCCTCAAGCTCTCCACAACA；PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用TIANGENMidPurificationKit普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行凝胶回收纯化后，得到TrPPA基因的3’和5’端序列，利用NCBIBlastN和DNAman6.0拼接得到TrPPA基因的cDNA全长序列如序列表SEQUENCEIDNO.1所示。4.TrPPA基因的过表达载体构建方法，其特征在于：首先，提取表达载体pBI121-35S的质粒，通过BamHI和SacI双酶切进行双酶切，将TrPPA基因的开放阅读框链接到酶切之后的pBI121-35S载体上，转化感受态细胞后，进行Kan抗性筛选，最后对菌液进行PCR验证，并对阳性菌落进行测序，若测序序列与原序列不相同，则表明转化不成功，重复上述步骤再次进行TrPPA基因的过表达载体构建，若测序序列与原序列相同，则表明转化成功，保存结果正确的菌液至超低温冰箱(-80℃)。5.TrPPA基因在低温、高温、盐胁迫和干旱胁迫中的应用。6.TrPP