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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108384812A(43)申请公布日2018.08.10(21)申请号201810064104.7(22)申请日2018.01.23(71)申请人华南理工大学地址510640广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人李爽陈和锋朱晁谊朱牧孜(74)专利代理机构广州市华学知识产权代理有限公司44245代理人宫爱鹏(51)Int.Cl.C12N15/90(2006.01)C12N9/22(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图1页(54)发明名称一种酵母基因组编辑载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种酵母基因组编辑载体及其构建方法和应用,以gRNA编码质粒P为出发载体,在该载体的复制起始点Ori两端分别引入同向34bp的LoxP序列,并在质粒P骨架位置引入Cre重组酶基因表达盒,获得酵母基因组编辑载体。该载体在以CRISPR/Cas9为媒介的基因编辑中的应用,能实现对酿酒酵母基因组的高效、多轮编辑。CN108384812ACN108384812A权利要求书1/1页1.一种酵母基因组编辑载体的构建方法,其特征在于,以gRNA编码质粒P为出发载体,在该载体的复制起始点Ori两端分别引入同向34bp的LoxP序列,并在质粒P骨架位置引入Cre重组酶基因表达盒,获得酵母基因组编辑载体。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述LoxP序列如SEQIDNO:1所示。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述Cre重组酶基因具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述出发载体为P426,并在P426的KpnI位点插入Cre重组酶表达盒。5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述表达盒中的启动子为半乳糖诱导的GAL1启动子,终止子为CYC1转录终止子。6.权利要求1~5任意一项所述方法构建的酵母基因组编辑载体。7.权利要求6所述载体在以CRISPR/Cas9为媒介的基因编辑中的应用,其特征在于,包括以下步骤:1)以权利要求6构建的载体出发载体,构建含有靶向gRNA基因序列的表达载体;2)将步骤1)得到gRNA表达载体导入含有相应Cas9系统的酿酒酵母,得到重组酿酒酵母,并在CRISPR/Cas9系统引导下实现基因组编辑;3)基因组编辑完成后,将重组酿酒酵母置于半乳糖培养基中诱导培养,阻断载体的自我复制,实现传代质粒丢失;4)筛选质粒丢失的重组酿酒酵母,导入新的gRNA表达载体进行下一轮基因组编辑。8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,重复步骤3)、4)实现多轮基因组编辑。9.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,步骤3)所述重组酿酒酵母在半乳糖培养基中诱导培养的条件:温度25-32℃,时间36-42h,转速150-300rpm。10.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,所述酿酒酵母为S.cerevisiaeBJ5464;所述Cas9系统为质粒p414-TEF1p-Cas9-CYC1t。2CN108384812A说明书1/7页一种酵母基因组编辑载体及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明涉及一种酿酒酵母基因组编辑的方法及其应用。该编辑方法是利用可实现自我丢失的通用载体,并结合CRISPR/Cas9系统,从而实现对酿酒酵母基因组的高效便捷的编辑。背景技术[0002]随着分子生物学的迅速发展,能够实现对生物体基因组精确编辑的多种基因组编辑(genomeediting)技术相继出现。该技术主要利用序列特异性的DNA结合结构域和非特异性的DNA修饰结构域组合而成的序列特异性核酸内切酶(sequencespecificnuclease,SSN)在基因组特定位置对双链DNA进行定向切割,进而激活细胞自身的修复机能来实现基因敲除、定点插入或替换等定向改造。[0003]目前,基因编辑技术主要有:锌指核酸酶(zincfingernuclease,ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)系统、规律成簇的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)/CRISPR关联蛋白(CRISPR-associatedproteins,Cas)系统、格氏嗜盐碱杆菌的Argonaute蛋白(NatronobacteriumgregoryiArgonaute,NgAgo)核酸酶和结构引导的内切酶(structure-guidednuclease,SGN)系统等。而在这其中近年来最为广泛应用的就是CRISPR/Ca