一种放线菌用新型基因表达载体pJXNU及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927431A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210869300.8C12P17/18(2006.01)(22)申请日2022.07.22C12R1/01(2006.01)C12R1/465(2006.01)(71)申请人江西师范大学地址330000江西省南昌市紫阳大道99号(72)发明人谢运昌张志斌陈奇杜思瑶朱笃黄运红袁涛倪海燕黎金祖刘文慧(74)专利代理机构广州科粤专利商标代理有限公司44001专利代理师刘明星陈洁娣(51)Int.Cl.C12N15/76(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书14页序列表（电子公布）附图5页(54)发明名称一种放线菌用新型基因表达载体pJXNU及其构建方法和应用(57)摘要本发明公开了一种放线菌用新型基因表达载体pJXNU及其构建方法和应用。该载体的序列如SEQIDNO.2所示，是在pSET152质粒基础上，加载了kanamycin和thiostrepton抗生素抗性基因，以及533bp如SEQIDNO.1所示的含3个基因表达元件序列和2套多克隆位点(multiplecloningsite/MCS)的DNA片段。该载体有2个自主表达的强效基因表达元件和1个thiostrepton诱导表达元件，可在一个载体上实现2个或2组基因的自主高效表达和(或)1个或1组基因的诱导表达，可在放线菌宿主内实现多类型的功能基因研究与应用。CN115927431ACN115927431A权利要求书1/1页1.一种放线菌用新型基因表达载体pJXNU的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用NheI处理pSET152质粒，获得线性化的质粒片段pSET152‑NheI；(2)以SuperCosI质粒为模板，扩增KanR片段，利用同源重组方法，将KanR克隆至pSET152‑NheI，获得目标质粒pSET152K；(3)使用NheI处理pSET152K，获得线性化的片段pSET152K‑NheI；(4)以pIJ6021质粒为模板，扩增ThioR片段，利用同源重组方法，将ThioR克隆至pSET152‑NheI，获得目标质粒pSET152KT；(5)合成如SEQIDNO.1所示的基因表达元件序列，利用EcoRV和XbaI的组合分别处理基因表达元件及pSET152KT质粒，将酶切后的片段连接，得到目标载体pJXNU。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，扩增KanR片段的引物为152KanIn‑Fr:5'‑ATCGGGCCCTGGCCAGCTAGCtggtaaggttgggaagccct‑3'和152KanIn‑Re:5'‑TGCAGGTCGACTCTAGCTAGtcagaagaactcgtcaagaag‑3'。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，扩增ThioR片段的引物为152ThioIn‑Fr:5'‑ATCGGGCCCTGGCCAGCTAGCggggatcgaccgcgcgggtc‑3'和152ThioIn‑Re:5'‑TTCCCAACCTTACCAGCTAGttatcggttggccgcgagat‑3'。4.一种根据权利要求1‑3任一项所述的构建方法构建得到的放线菌用新型基因表达载体pJXNU。5.根据权利要求4所述的表达载体pJXNU，其特征在于，所述载体pJXNU的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。6.一种含有权利要求5所述的表达载体pJXNU的细菌。7.根据权利要求6所述的细菌，其特征在于，所述的细菌为放线菌。8.权利要求4所述的表达载体pJXNU在放线菌基因表达中的应用。9.权利要求4所述的表达载体pJXNU在Beta‑咔啉生物碱1‑acety‑3‑carboxy‑β‑carboline生物合成基因簇mcb异源表达中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，是在放线菌中异源表达Beta‑咔啉生物碱1‑acety‑3‑carboxy‑β‑carboline生物合成基因簇mcb的应用。2CN115927431A说明书1/14页一种放线菌用新型基因表达载体pJXNU及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种含有3个基因表达元件(2个自主表达和1个可诱导表达)的放线菌用工具质粒(载体)，及该载体在Beta‑咔啉生物碱marinacarboline生物合成基因簇mcb异源表达中的应用。背景技术[0002]放线菌细胞含有大量的次级代谢产物生物合成基因与基因簇，可利用高效基因表达载体克隆相关的基因(簇)，原位导入菌株自身细胞内，或者导入