云锦杜鹃SAMT基因过表达载体及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115058439A(43)申请公布日2022.09.16(21)申请号202210606268.4(22)申请日2022.05.31(71)申请人浙江万里学院地址315100浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号(72)发明人吴月燕杨国霞贾永红(74)专利代理机构宁波甬致专利代理有限公司33228专利代理师李迎春(51)Int.Cl.C12N15/54(2006.01)C12N15/82(2006.01)C12N15/66(2006.01)A01H5/02(2018.01)A01H6/36(2018.01)权利要求书2页说明书7页序列表6页附图5页(54)发明名称云锦杜鹃SAMT基因过表达载体及其构建方法和应用(57)摘要本发明提供了一种云锦杜鹃RhSAMT基因过表达载体，所述过表达载体为将云锦杜鹃RhSAMT基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV35启动子和mgfp5荧光序列之间并替换pCAMBIA1302原始载体序列的“atg”3个碱基，删除原始载体序列“tcttgac”7个碱基，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体。本发明还提供了上述过表达载体的构建方法和应用，通过本发明能够对云锦杜鹃花香进行调控，本发明具有较高的商业价值与推广价值。CN115058439ACN115058439A权利要求书1/2页1.一种云锦杜鹃RhSAMT基因过表达载体，其特征在于，所述过表达载体为将云锦杜鹃RhSAMT基因的目的片段插入pCAMBIA1302原始载体的CaMV35启动子和mgfp5荧光序列之间并替换pCAMBIA1302原始载体序列的“atg”3个碱基，删除原始载体序列“tcttgac”7个碱基，且删除目的片段的终止密码子得到的pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体。2.根据权利要求1所述的云锦杜鹃RhSAMT基因过表达载体，其特征在于，所述云锦杜鹃RhSAMT基因过表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种权利要求1‑2任一项所述云锦杜鹃RhSAMT基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：云锦杜鹃RhSAMT基因的编码区的克隆：S1.1：提取云锦杜鹃花瓣的RNA，逆转录为cDNA，并将cDNA保存于‑20℃的环境下中备用；S1.2：采用同源克隆及RACE技术克隆获得SAMT基因的全长序列，选择其中的CDS编码区，设计引物SAMT‑F和SAMT‑R用于PCR扩增；S1.3：以cDNA为模板，利用SAMT‑F和SAMT‑R进行PCR扩增反应，得到PCR产物；将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到目的片段；将得到的目的片段连接Blunt载体，转入大肠杆菌T1感受态细胞；将转化后的大肠杆菌培养；即获得云锦杜鹃SAMT基因的目的片段；S2：pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体的质粒设计：选定市售pCAMBIA1302原始载体的CaMV35启动子和mgfp5荧光序列之间的位置作为云锦杜鹃SAMT基因的目的片段的引物插入位点，在插入位点的前后保持3倍数碱基对，先于pCAMBIA1302原始载体序列删除“atg”3个碱基，并在删除位置插入步骤S1.3获得的云锦杜鹃SAMT基因的目的片段，替换pCAMBIA1302原始载体的“atg”3个碱基，删除原始载体序列“tcttgac”7个碱基，且删除目的片段的终止密码子，完成pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体的质粒设计；S3：获得pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体的质粒：S3.1：根据设计好的pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体序列，利用同源序列无缝克隆的原理，第一步，在云锦杜鹃SAMT基因的目的片段的起始密码子前选择10‑15个碱基序列，在云锦杜鹃SAMT基因的目的片段删除的终止密码子后选择10‑15个碱基序列；第二步，在云锦杜鹃SAMT基因的目的片段的头尾各选择15‑20个碱基序列，与第一步中选择的碱基序列各自拼接后得到引物G‑SAMT‑F和G‑SAMT‑R；S3.2：利用G‑SAMT‑F和G‑SAMT‑R对SAMT基因的目的片段进行巢式PCR反应，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到含有与pCAMBIA1302载体同源序列的目的片段，为第一产物，放入‑20℃的环境下等待备用；S3.3：用NcoI‑HF对pCAMBIA1302质粒进行单酶切，获得线性化载体，对线性化载体进行琼脂糖凝胶电泳，对目标条带进行回收，得到第二产物，放入‑20℃的环境下等待备用；S3.4：将第一产物与第二产物遵循一步克隆法进行连接，连接后转化、涂板，获得阳性质粒，即得到pCAMBIA1302‑SAMT过表达载体