克拉霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106589024A(43)申请公布日2017.04.26(21)申请号201611125939.6C07K14/765(2006.01)(22)申请日2016.12.09C07K14/795(2006.01)C07K16/44(2006.01)(71)申请人深圳市绿诗源生物技术有限公司G01N33/53(2006.01)地址518000广东省深圳市大鹏新区大鹏G01N33/577(2006.01)办事处布新社区布新村工业大道2号D栋101.201.301(72)发明人宁波李隆军刘明如赖启隆朱永利蒋永青吴育春(74)专利代理机构广州市越秀区海心联合专利代理事务所(普通合伙)44295代理人王海曼(51)Int.Cl.C07H17/08(2006.01)C07H1/00(2006.01)权利要求书2页说明书10页附图2页(54)发明名称克拉霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法应用(57)摘要本发明公开了一种克拉霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法应用，旨在提供既能最大程度保留了克拉霉素的特征结构，又具有可以与载体蛋白发生偶联的活性基团的克拉霉素半抗原，并且以克拉霉素半抗原制备人工抗原和抗体，用来检测检测大环内酯类化合物中，其技术方案，所述克拉霉素半抗原，所述结构如下式所示：所述克拉霉素人工抗原为所述克拉霉素半抗原与载体蛋白偶联制得的；属于生物技术领域；CN106589024ACN106589024A权利要求书1/2页1.一种克拉霉素半抗原，其特征在于，所述结构如式I所示：2.制备权利要求1所述克拉霉素半抗原的方法，其特征在于，依次包括下述步骤包括如下步骤：1)称取克拉霉素置于反应瓶，加入有机溶剂使其溶解，再称取丁二酸酐置于反应瓶，再向反应瓶加入三乙胺，在下室温，磁力搅拌反应3～5小时；2)将反应的产物后减压旋蒸，浓缩，加入去离子水，调节pH为4.5-5.5，析出灰白色固体，过滤，取滤饼，用混合溶剂(2)15ml结晶，过滤，干燥，得到产物；其中：所述的克拉霉素和丁二酸酐摩尔比1:1.0～1.5。3.根据权利要求1所述的克拉霉素半抗原的制备方法，其特征在于，所述的催化剂为三乙胺；4.根据权利要求1所述的克拉霉素半抗原的制备方法，其特征在于，所述的混合溶剂为体积比1:2的乙酸乙酯和正己烷。5.一种由权利要求1所述的克拉霉素半抗原制备的克拉霉素包被原，其特征在于，所述的克拉霉素包被原由所述克拉霉素半抗原与牛血清白蛋白偶联制得的，结构式如式Ⅱ所示：6.一种由权利要求1所述的克拉霉素半抗原制备的克拉霉素免疫原，其特征在于，所述2CN106589024A权利要求书2/2页的克拉霉素免疫原由所述克拉霉素半抗原与鲎血蓝蛋白偶联制得的，结构式如式Ⅲ所示：7.一种克拉霉素单克隆抗体，其特征在于，依次通过下述步骤制得：1)动物免疫将权利要求5所述的克拉霉素免疫原免疫Balb/c小鼠；2)细胞融合与筛选取冲击免疫后第三天的小鼠脾脏与SP2/O骨髓瘤细胞融合，融合后第七天采用间接竞争ELISA测定细胞上清，筛选阳性且有抑制孔进行亚克隆，经过3次以上克隆化培养，直至克隆阳性率为100％，得到一株可分泌克拉霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为抗克拉霉素单克隆抗体杂交瘤细胞CLF3；3)腹水单抗的制备与纯化用步骤2)制备的抗克拉霉素单克隆抗体杂交瘤细胞CLF3注射Balb/c小鼠，待小鼠腹部明显膨大，采取腹水，采用ProteinA蛋白亲和层析柱对腹水进行纯化，纯化后的腹水保存于-20℃；测定单克隆抗体浓度的蛋白浓度为3.6mg/mL，并且对单克隆抗体鉴定。8.权利要求7所述的克拉霉素单克隆抗体在检测克拉霉素中的应用9.利要求7所述的克拉霉素单克隆抗体在检测在检测大环内酯类化合物中的应用。3CN106589024A说明书1/10页克拉霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法应用技术领域[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及克拉霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法应用。背景技术[0002]克拉霉素属于大环内酯类抗生素，对大多数革兰阳性菌、部分革兰阴性菌及一些非典型致病菌(支原体、衣原体等)均有效。是红霉素的第二代衍生物之一。红霉素的第二代衍生物主要成员有罗红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素等。由于其第二代衍生物避免了被胃酸破坏，提高了吸收率，抗菌活性更强，因而广泛用于治疗呼吸道感染的一线药物。[0003]但近来有报道，红霉素第二代衍生物长期、持续的给药，对肝脏有毒害；对前庭系统有影响，能引起耳鸣、听觉障碍等；还能引起药热、药疹、荨麻疹等过敏反应以及部分药物可引起腹痛、腹泻、恶心等胃肠道反应；其中，克拉霉素、阿奇霉素等可能发生幻觉、失眠、意识模糊等中枢神经系统副作用，以及易透过胎盘