多杀菌素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111875652A(43)申请公布日2020.11.03(21)申请号202010697076.XC07K16/44(2006.01)(22)申请日2020.07.20G01N33/53(2006.01)(71)申请人北京勤邦生物技术有限公司地址102206北京市昌平区回龙观国际信息产业基地高新四街8号申请人北京望尔生物技术有限公司(72)发明人万宇平王兆芹冯月君王琳琛徐念琴张坤杨春艳张彩丽(51)Int.Cl.C07H17/08(2006.01)C07H1/00(2006.01)C07H1/06(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K14/795(2006.01)C07K1/107(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图1页(54)发明名称多杀菌素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了多杀菌素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明提供的多杀菌素半抗原既最大程度保留了多杀菌素的特征结构，使得多杀菌素半抗原的免疫原性明显增强，又具有可以与载体蛋白发生偶联的羧基；用多杀菌素半抗原与载体蛋白偶联后得到的多杀菌素人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经检测多杀菌素抗体的灵敏度可达1μg/L，与其他大环内酯类杀虫剂的交叉反应率低，为后续建立多杀菌素的各种免疫分析方法提供了基础。CN111875652ACN111875652A权利要求书1/2页1.一种多杀菌素半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：2.如权利要求1所述的多杀菌素半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)在过氧化物作用下，多杀菌素与溴化氢发生加成反应，得到溴代多杀菌素，所述溴代多杀菌素具有结构式2)在碱性条件下，溴代多杀菌素与氨基丁酸发生亲核取代反应，得到多杀菌素半抗原。3.如权利要求2所述的多杀菌素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述过氧化物为间氯过氧苯甲酸；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为无水四氯化碳；所述反应条件为：将干燥的溴化氢气体通入含有间氯过氧苯甲酸的无水四氯化碳中，搅拌1h，再滴加含有多杀菌素的无水四氯化碳，室温继续搅拌2h；所述步骤1)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：在反应体系中加入水，充分震荡，静置，分去水相，有机相蒸干得到溴代多杀菌素。4.如权利要求2所述的多杀菌素半抗原的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述碱性条件由无水碳酸钾提供，所述溴代多杀菌素、氨基丁酸的物质的量之比为1∶(5～6)；所述反应在溶剂中进行，所述溶剂为乙腈；所述反应需要催化剂的参与，所述催化剂为无水碘化钠；所述反应条件为：油浴加热回流反应4h；所述步骤2)反应结束后，还包括对反应体系进行后处理的步骤，具体如下：在反应体系2CN111875652A权利要求书2/2页中加入水，加乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，蒸干，用硅胶柱纯化，然后用二氯甲烷和甲醇体积比为10:1的混合溶剂洗脱分离获得多杀菌素半抗原。5.一种多杀菌素人工抗原，其特征在于，其是载体蛋白和权利要求1所述的多杀菌素半抗原偶联得到的偶联物。6.如权利要求5所述的多杀菌素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。7.如权利要求5或6所述的多杀菌素人工抗原的制备方法，其特征在于，采用活泼酯法将载体蛋白偶联于权利要求1所述多杀菌素半抗原的羧基上。8.一种多杀菌素抗体，其特征在于，它是由权利要求5所述的多杀菌素人工抗原经动物免疫得到，其能与多杀菌素发生特异性免疫反应。9.一种权利要求8所述的多杀菌素抗体在检测多杀菌素残留中的应用。3CN111875652A说明书1/6页多杀菌素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及多杀菌素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。背景技术[0002]多杀菌素是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，其活性成分为多杀菌素A和多杀菌素D，统称为多杀菌素(spinosad)。因其具有杀虫谱广、杀虫活性高、对非靶标动物安全、分解产物安全等特点，已广泛用于棉花等超过150种作物上的鳞翅目和双翅目以及叶蝉、蜘蛛螨、跳蚤和虱子等害虫防治，尤其对鳞翅目害虫的防治效果好。但其残留超标仍然可能会影响食品安全以及环境安全，因此我国国家标准GB2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了不同食品中多杀菌素的残留限量。[0003]目前，国内外检测多杀菌素主要采用气相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱串联质谱法等分析方法，存在样品前处