龙葵素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113896758A(43)申请公布日2022.01.07(21)申请号202111132274.2(22)申请日2021.09.27(71)申请人浙江省食品药品检验研究院地址310052浙江省杭州市滨江区平乐街325号(72)发明人刘柱陈碧莲徐潇颖华颖王峰赵超群(51)Int.Cl.C07J71/00(2006.01)C07K14/765(2006.01)C07K14/77(2006.01)C07K14/795(2006.01)C07K16/44(2006.01)G01N33/53(2006.01)C07K1/107(2006.01)权利要求书1页说明书5页附图1页(54)发明名称龙葵素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了龙葵素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用，本发明提供的龙葵素半抗原最大程度保留了龙葵素的特征结构，又引入三碳链羧基基团，使得龙葵素半抗原的免疫原性明显增强；用龙葵素半抗原与载体蛋白偶联后得到的龙葵素人工抗原去免疫动物，更有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体，经间接竞争酶联免疫法检测，龙葵素抗体对α‑茄碱的灵敏度为1μg/L，与α‑卡茄碱的交叉反应率为87％，为后续建立龙葵素的各种免疫分析方法提供了基础。CN113896758ACN113896758A权利要求书1/1页1.一种龙葵素半抗原，其特征在于，其具有如下结构式：2.如权利要求1所述的龙葵素半抗原的制备方法，其特征在于，其是通过引发剂过氧化双月桂酰，由α‑茄碱与巯基丙酸进行加成反应得到的。3.如权利要求2所述的龙葵素半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法为：取α‑茄碱加环己烷溶解，加巯基丙酸充分搅拌后，加入过氧化双月桂酰，室温搅拌反应，然后进行分离纯化得到龙葵素半抗原；其中，所述α‑茄碱、巯基丙酸、过氧化双月桂酰的摩尔比为4∶12∶1。4.如权利要求2所述的龙葵素半抗原的制备方法，其特征在于，该制备方法的具体步骤如下：取α‑茄碱0.868g加200mL干燥的环己烷溶解，加巯基丙酸0.318g充分搅拌后，加入过氧化双月桂酰0.1g，室温搅拌反应4h，停止反应，加0～4℃冷水50mL，搅拌，静置，分去水相，有机相蒸干，得到黄色油状物，无水乙醇60mL加热溶解，重结晶，得到龙葵素半抗原。5.一种龙葵素人工抗原，其特征在于，其是载体蛋白和权利要求1所述的龙葵素半抗原偶联得到的偶联物。6.如权利要求5所述的龙葵素人工抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白。7.一种龙葵素抗体，其特征在于，它是由权利要求5所述的龙葵素人工抗原经动物免疫得到，其能与龙葵素发生特异性免疫反应。8.一种权利要求7所述的龙葵素抗体在检测龙葵素残留中的应用。2CN113896758A说明书1/5页龙葵素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于食品安全检测领域。更具体地，本发明涉及龙葵素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和应用。背景技术[0002]龙葵素是一种有毒糖苷类生物碱，又名茄碱，是植物生长过程中的次生代谢物，由茄啶与葡萄糖、木糖、鼠李糖以及半乳糖形成糖基配位体，其结构可根据连接的基团分为茄碱和卡茄碱，其中占比最大的是α‑茄碱和α‑卡茄碱，可达95％。龙葵素广泛存在于茄科植物(番茄、茄子和马铃薯等)中，具有一定的毒性，其毒性机制主要包括抑制体内的胆碱酯酶的活性以及与生物膜上的甾醇类物质结合引起毒性反应。中毒者会出现消化系统失衡、胃肠肌肉痉挛等症状，严重者体温升高、反复呕吐甚至昏迷抽搐、呼吸中枢麻痹而死亡。近年来，越来越多的人们喜爱食用马铃薯，食用方法也丰富多样，因而也增加了龙葵素中毒的风险，每年都有不少人因龙葵素中毒而入院治疗，因此龙葵素检测技术的发展显得尤为紧迫。[0003]目前，龙葵素主要检测方法包括比色法、薄层色谱法、高效液相色谱法、液相色谱‑质谱联用法等。比色法和薄层色谱法准确度低，难以应用于高灵敏度定量分析；高效液相色谱法能够检测高浓度含量的龙葵素样品，但是对于低浓度样品则无法进行准确的检测，且主要使用C18柱进行分离，α‑茄碱和α‑卡茄碱的分离效果不够理想；液相色谱‑质谱联用法可对样品中微量的龙葵素进行检测，样品的回收率高，灵敏度高、重复性好，可用于样品中低含量α‑茄碱的含量测定，是目前最常用的检测方法。但这些方法都存在样品前处理繁琐、检测时间长、仪器贵重等缺点，在我国无法得到广泛应用，并且不符合现场检测“在短时间内低成本对大量样品进行准确检测和筛选”的要求。而免疫学检测分析技术以其高灵敏、特异性高、快速、操作简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用，比起仪器等检验方法有很多