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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106967747A(43)申请公布日2017.07.21(21)申请号201710167823.7(22)申请日2017.03.21(71)申请人上海科维创生物科技有限公司地址200120上海市浦东新区自由贸易试验区蔡伦路150号1幢2楼上海科维创生物科技有限公司申请人汉恒生物科技(上海)有限公司(72)发明人陈意雄朱鹏飞蔡晓龙邹杰(74)专利代理机构常州市权航专利代理有限公司32280代理人黄晶晶(51)Int.Cl.C12N15/85(2006.01)C12N5/10(2006.01)C12N5/071(2010.01)权利要求书2页说明书7页附图1页(54)发明名称外泌体的分离方法(57)摘要本发明提供一种外泌体的分离方法,所述分离方法至少包括以下步骤:(1)向目标细胞中导入带有标签的CD63,培养;(2)离心后取上清液;(3)向上清液中加入磁性体,所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物,孵育;(4)将上清液置于磁场中;(5)去除上清液后加入缓冲液,加入分选柱,利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体,并收集。采用本发明所述的收集方法,收集效率高。CN106967747ACN106967747A权利要求书1/2页1.一种外泌体的分离方法,其特征在于,所述分离方法至少包括以下步骤:向目标细胞中导入带有标签的CD63,使用细胞培养基进行培养;离心后取上清液;向上清液中加入磁性体,所述磁性体上含有能够与CD63上的标签特异性结合的标记物,孵育;将上清液置于磁场中;去除上清液后加入缓冲液,加入分选柱,利用缓冲液洗脱分选柱上滞留的外泌体,并收集。2.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于:所述标签选自Flag、His6、GST、MBP、His-MBP、HA中的任意一种或几种。3.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于:所述步骤(1)还包括以下技术特征中的任意一种或几种:所述CD63通过载体携带导入目标细胞;向目标细胞中导入带有标签的CD63后培养12~36h,然后筛选出含有CD63的阳性克隆细胞,再继续培养阳性克隆细胞。4.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于:所述步骤(2)还包括以下技术特征中的任意一种或几种:离心前清洗细胞;所述离心的条件为1000g离心5min,随后4℃12000g离心30min;向离心后的上清液中加入缓冲液。5.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于:所述步骤(3)中孵育的温度为2~5℃,时间15~20分钟。6.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于:所述步骤(4)将上清液置于磁场中的同时离心,离心的条件为1500~4500r/min,时间5~20min。7.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于,所述步骤(1)中CD63通过pCD63-3*Flag导入目标细胞,所述pCD63-3*Flag通过载体、CD63片段和3flag片段按1:3:3的摩尔比加入到HB-infusion无缝克隆试剂获得。8.根据权利要求1所述的外泌体的分离方法,其特征在于,所述步骤(1)中所述细胞培养基包括以下组分:无水氯化钙265mg/L氯化钾400mg/L无水硫酸镁97mg/L氯化钠6400mg/L无水磷酸二氢钠109mg/L丁二酸75mg/L丁二酸钠100mg/L氨基酸990mg/L葡萄糖1000mg/L酚红9.30.00mg/L2CN106967747A权利要求书2/2页丁酸钠20mg/L。9.根据权利要求8所述的外泌体的分离方法,其特征在于,所述氨基酸选自L-盐酸精氨酸、L-盐酸胱氨酸、甘氨酸、L-盐酸组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-盐酸赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸中的任意一种或几种。3CN106967747A说明书1/7页外泌体的分离方法技术领域[0001]本发明涉及一种外泌体的分离方法,属于生物技术领域。背景技术[0002]外泌体(exosome)是由细胞内多泡体(multivesicularbody,MVB)与细胞膜融合后,释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm的膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程时发现。又经过多年研究,科学家发现除了网织红细胞以外,T细胞、B细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌外泌体,被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中,通过循环系统到达其他细胞与组织,产生远程调控作用。[0003]外泌体中包含多种RNA分子,包括mRNA、miRNA等。但也有少数报道指出,某些