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本发明涉及一种外泌体分离纯化方法,取含有外泌体的体液或培养液,经过阴离子交换层析、阳离子交换层析和分子筛层析后获得纯化后的外泌体溶液。通过这样的提纯方法即便在大规模的外泌体需求中,也能够低成本、高效率的获得高纯度的外泌体;与现有的外泌体纯化方法如离心法、PEG多聚物沉淀法、亲和层析法、超滤法、分子筛尺寸排阻色谱法相比,本发明可以实现不同体积(100ml至500L)外泌体纯化,尤其杂质蛋白较多的乳源制品,也可获得纯度99%以上的乳源外泌体,同时具有低成本及高回收率的优势,能满足工业化生产的需求。