一种角膜基质、制备方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107050515A(43)申请公布日2017.08.18(21)申请号201710125099.1(22)申请日2017.03.03(71)申请人北京博辉瑞进生物科技有限公司地址102600北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地药谷一号国际研发孵化园6#厂房西侧(72)发明人赵博夏磊磊王洪权赵延瑞李学军张晋辉(74)专利代理机构宁波市鄞州甬致专利代理事务所(普通合伙)33228代理人沈春红(51)Int.Cl.A61L27/36(2006.01)A61L27/50(2006.01)权利要求书2页说明书9页附图3页(54)发明名称一种角膜基质、制备方法与应用(57)摘要本发明提供一种角膜基质、制备方法与应用，采用动物的眼角膜为原料，去除角膜上皮层、角膜基质中的细胞成分和DNA成分，保留前弹力层和部分厚度角膜基质，保留完整的细胞外基质成分；该角膜基质适用于病变角膜的覆盖，尤其适用于用药无效的尚未穿孔角膜溃疡、需要板层移植治疗的感染性角膜炎患者，以及角膜穿孔的临时性覆盖。CN107050515ACN107050515A权利要求书1/2页1.一种角膜基质，其特征在于：采用动物的眼角膜为原料，去除角膜上皮层、角膜基质中的细胞成分和DNA成分，保留前弹力层和部分厚度角膜基质，保留完整的细胞外基质成分。2.根据权利要求1所述的角膜基质，其特征在于：所述动物为哺乳动物，优选猪或牛。3.根据权利要求1所述的角膜基质，其特征在于：所述的部分厚度角膜基质为与前弹力层相连的具有一定厚度的角膜基质，所述的细胞外基质包括胶原蛋白和糖胺聚糖。4.根据权利要求3所述的角膜基质，其特征在于：所述胶原蛋白为I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白，所述I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的含量为85-90％；所述糖胺聚糖为硫酸软骨素和硫酸角质素；所述角膜基质为直径7-10cm，厚度0.1-0.2mm的圆片；所述去除角膜上皮层、角膜基质中的细胞成分和DNA成分是指所述细胞残留量为0个、DNA残留量小于10ng/mg、半乳糖甘酶清除率为99％以上。5.一种角膜基质的制备方法，其特征在于：制备方步骤包括：(1)原料处理：取动物的眼球，取角膜、清洗后浸泡于纯化水中；(2)冻融溶胀：角膜先用水浸泡，再冷冻；冷冻后取出、待完全解冻后用纯化水冲洗，然后再浸泡；重复上述冷冻、解冻过程多次，得到吸水膨胀的角膜；(3)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡角膜进行病毒灭活；(4)清洗过程：分别用PBS溶液和纯化水在超声装置中处理角膜；(5)免疫原去除：免疫原去除液为PBS溶液，所述PBS溶液中包含胰蛋白酶和EDTA，角膜的免疫原去除过程在超声装置中进行；(6)清洗过程：分别用PBS溶液和纯化水在超声装置中处理角膜；(7)重复步骤(5)和(6)多次，然后将角膜浸泡在纯化水中；(8)切削取材：在解剖镜下使用角膜板层刀，切取角膜前弹力层和部分基质、然后将其浸泡于纯化水中；(9)烘干干燥：将角膜平展在支撑件表面，放置在烘箱中进行干燥获得角膜基质。6.根据权利要求5所述的角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤(3)过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1-5％、乙醇的体积百分比浓度为5-40％，过氧乙酸-乙醇溶液与角膜的体积比为(30-60)︰1，灭活时间2-4h，温度范围为10-40℃；步骤(4)清洗过程，其中的PBS溶液pH6-8、溶液温度为10-40℃，PBS溶液与角膜的体积比为(30-60)︰1，清洗2-4次，每次10-30min；然后采用10-40℃的注射用水清洗，注射用水与角膜体积比为(30-60)︰1，至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行；步骤(5)中的免疫源去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2％，EDTA的浓度0.1-1mmol/L，免疫源去除液的pH值为7-8；多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃；步骤(6)的清洗过程，其中的PBS溶液pH6-8、溶液温度为10-40℃，PBS溶液与角膜的体2CN107050515A权利要求书2/2页积比为(30-60)︰1，清洗2-4次，每次10-30min，然后采用10-40℃的注射用水清洗，注射用水与角膜的体积比为(30-60)︰1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μs/cm终止；所述步骤(9)烘干干燥在热循环烘箱中进行，将烘箱预热至25-40℃后，将步骤(8)所得材料放于烘箱干燥，通过热循环风将水分风干，时间12-24小时。7.根据权利要求6所述的角膜基质的制备方法，其特征在