一种组织工程人角膜基质载体支架及其制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102552975A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102552975A(43)申请公布日2012.07.11(21)申请号201210047554.8A61L27/20(2006.01)(22)申请日2012.02.28(71)申请人青岛中皓生物工程有限公司地址266061山东省青岛市崂山区香港东路248号(72)发明人王宝泉李荣福杜玉堂樊现远郝萧(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司37201代理人张中南(51)Int.Cl.A61L27/24(2006.01)权利要求书权利要求书11页页说明书说明书44页页(54)发明名称一种组织工程人角膜基质载体支架及其制备方法(57)摘要本发明涉及一种利用海水鱼类胶原蛋白制备组织工程人角膜基质载体支架的方法，是采用非酶解鳕鱼皮胶原蛋白冻干粉充分溶解于盐酸中，离心去除沉淀后将上清液分装入培养板孔中冻干，加入含硫酸软骨素的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺交联剂进行交联，用碱性Na2HPO4溶液稳定交联效果后，先后用2MNaCl、1MNaCl和蒸馏水清洗，冻干后即可作为组织工程人角膜基质的载体支架使用。本发明工艺科学合理，所制备的载体支架可用于批量生产，满足组织工程人工角膜基质规模化重建对载体支架的大量需求，为人角膜基质病盲通过临床角膜移植和重见光明创造条件，且此载体支架制备以及应用于组织工程人工角膜基质体外重建和临床治疗的成本低。CN102597ACN102552975A权利要求书1/1页1.组织工程人角膜基质载体支架，其特征在于所述的载体支架是以鱼皮胶原蛋白复合硫酸软骨素制备出的。2.如权利要求1所述的载体支架，其特征在于所述的鱼皮胶原蛋白的质量百分比为20％-40％，硫酸软骨素的含量为60％-80％。3.权利要求1所述的载体支架的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)将海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉溶解于盐酸中制成干粉溶液，离心过滤后加入到培养孔中冷冻干燥冻干；2)将N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶解于2-吗啉乙磺酸-40％乙醇溶液中，制成NHS溶液，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺溶液混匀制成交联剂溶液，最后加入硫酸软骨素，制成含硫酸软骨素的交联剂溶液；3)向含有海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉的培养孔中加入含硫酸软骨素的交联剂溶液，于室温下交联处理后，用Na2HPO4溶液清洗稳定交联效果；再用NaCl溶液清洗去除交联剂；最后，用蒸馏水清洗冻干后完成支架的制备。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中盐酸浓度为0.01M-0.02M，制成的干粉溶液的浓度为5mg/ml-10mg/ml。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)的干粉溶液中又添加了质量百分比为0.05％-0.1％的IV型胶原蛋白。6.如权利要求3或5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)的干粉溶液中又添加了质量百分比0.05‰-0.1‰的纤连蛋白。7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于50mM的2-吗啉乙磺酸-40％乙醇溶液中，制成6mM的N-羟基琥珀酰亚胺溶液。8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的步骤2)中的硫酸软骨素在含硫酸软骨素的交联剂溶液中的终浓度为2.4％-2.5％。9.如权利要求1所述的载体支架，其特征在于所述的海水鱼类非酶解鱼皮胶原蛋白冻干粉为鳕鱼等深海鱼皮非酶解胶原蛋白冻干粉。2CN102552975A说明书1/4页一种组织工程人角膜基质载体支架及其制备方法技术领域[0001]本发明属于人角膜培养技术领域，具体涉及一种组织工程人角膜基质载体支架，即利用海水鱼类胶原蛋白制备的组织工程人角膜基质载体支架。背景技术[0002]人角膜基质层占角膜厚度的90％，主要由角膜基质细胞和胶原纤维等细胞外基质成分规则排列而成，透明且具有一定的曲率半径，有利于光线通过和折曲，在维持整个角膜的透明度和曲光率等方面具有至关重要的作用。角膜基质层一旦受到任何外伤或炎症破坏，通常会导致角膜水肿、不透明和瘢痕形成，由于角膜基质层中没有血管故而代谢缓慢，病理代谢产物很难完全去除，即使愈合后也会留下不同程度的混浊从而使视力受损，即角膜翳(cornealnebula)。绝大多数角膜基质病盲患者均可以通过角膜移植手术来治愈，但由于捐献角膜的高度匮乏致使绝大部分患者得不到供体角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起及其快速发展，使组织工程人角膜基质的体外重建及其临床应用成为可能，也为角膜基质病盲患者通过组织工程人角膜基质的移植和重见光明创造了条件。[0003]对组织工程人角膜基质的体外重建研究开始于上个世纪末，如何获得足量的人角膜基质