一种脱细胞人源角膜基质的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111840644A(43)申请公布日2020.10.30(21)申请号202010815050.0(22)申请日2020.08.13(71)申请人镇江雷音再生医学科技有限公司地址212000江苏省镇江市新区楚桥路99号中心研发区31号楼(72)发明人郭文广蔡枫苏萍肖丹许伟吴佳宇(74)专利代理机构南京创略知识产权代理事务所(普通合伙)32358代理人吕娟(51)Int.Cl.A61L27/36(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种脱细胞人源角膜基质的制备方法(57)摘要本发明公开一种脱细胞人源角膜基质的制备方法，包括1）细胞前处理：使用含1％（V/V）青霉素‑链霉素‑两性霉素B(100×三抗)混合溶液的缓冲液冲洗，有效杀灭细菌和真菌，防止污染；2）细胞破碎处理：采用渗透压冲击法破碎细胞，细胞溶胀破裂同时能够很好地保持角膜基质的组织生理结构及胶原纤维的形态；3）酶消化处理：采用核酸酶处理有效的去除细胞的DNA和RNA成分，脱细胞处理安全彻底；4）漂洗与修复：清洗角膜细胞残留同时对角膜胶原纤维具有保护作用，促进角膜创口的自我修复；5）灭菌。本发明制备方法，脱细胞完全，对角膜基质胶原无损伤，可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。CN111840644ACN111840644A权利要求书1/1页1.一种脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：包括步骤如下：1）脱细胞前处理：将来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于配制好的洗涤液中清洗，进行脱细胞前处理；2）细胞破碎处理：采用渗透压冲击法使人角膜基质材料上残留细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的DNA和RNA成分；3）酶消化处理：采用DNA酶和RNA酶的联合作用，去除细胞破裂释放的DNA及RNA成分；4）漂洗与修复：采用配制好的修复液对人角膜基质材料进行漂洗，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口；5）灭菌：采用钴-60或电子束辐照对人角膜基质材料进行灭菌处理，从而完成制备，获得脱细胞人源角膜基质。2.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤1）中，所述脱细胞前处理，人角膜基质材料于洗涤液中清洗的次数为2～3次；冲洗时间为每次1～3min。3.根据权利要求2所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述洗涤液为含1％体积分数的青霉素-链霉素-两性霉素B混合溶液的PBS或HBSS缓冲液。4.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤2）中，所述渗透压冲击法为高渗液-低渗液冲击法，即将人角膜基质材料先置于高渗液中，浸泡2～6h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入低渗液中浸泡3～5h，使细胞快速溶胀，细胞膜和核膜破裂。5.根据权利要求4所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述高渗液为1.5mol/L的NaCl溶液；所述低渗液为三蒸水。6.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述酶消化处理为使用含有DNA酶和RNA酶的PBS或HBSS缓冲液进行处理，处理的温度为25～35℃，处理时间为1h。7.根据权利要求6所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述缓冲液中DNA酶和RNA酶的浓度均为500～1000U/ml。8.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤4）中，所述漂洗与修复，漂洗的次数为2～3次，漂洗时间为每次2～5h。9.根据权利要求8所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：所述漂洗修复所用修复液的溶剂为三蒸水，修复液的组分中含有0.8～2%（重量）的透明质酸、1.0～2.5%（重量）的硫酸软骨素和0.5～2.5%（重量）的低分子量右旋糖酐。10.根据权利要求1所述的脱细胞人源角膜基质的制备方法，其特征在于：步骤5）中，所述灭菌，采用钴-60或电子束辐照的剂量为15～25kGy。2CN111840644A说明书1/5页一种脱细胞人源角膜基质的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种脱细胞人源角膜基质的制备方法。背景技术[0002]中国角膜病致盲者约500万左右，仅次于白内障，居眼科致盲疾病的第二位，约80％的患者可通过角膜移植来避免致盲。但我国由于受到传统观念和眼库条件的限制，角膜捐献者数量很有限，治疗成本昂贵。近代组织工程角膜研究的兴起和发展为寻找角膜替代材料开辟了另一个方向，随后也出现了合成材料和天然生物材料的角膜替代物，这些材料虽然具有良好的生物相容性，移植后可维持眼球的完整，并能在一定程度上恢复角膜的透明度，但由于其缺少天然角膜的结构，依然存在很多不足，例如透明度不高，移植后降解过快，生物力学