快速检测草甘膦残留的试剂盒及草甘膦残留的检测方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107478828A(43)申请公布日2017.12.15(21)申请号201710874197.5(22)申请日2017.09.25(71)申请人河南科技大学地址471000河南省洛阳市洛龙区开元大道263号(72)发明人王耀裴亚峰刘丽莉陈秀金樊振江李兆周任国艳高红丽李道敏曹力李燕虹曹金博金东亮(74)专利代理机构北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙)11371代理人王晖(51)Int.Cl.G01N33/558(2006.01)G01N33/535(2006.01)权利要求书2页说明书12页附图3页(54)发明名称快速检测草甘膦残留的试剂盒及草甘膦残留的检测方法和应用(57)摘要本发明提供了快速检测草甘膦残留的试剂盒及草甘膦残留的检测方法和应用，涉及草甘膦检测技术领域。该试剂盒包括检测板、草甘膦抗体溶液、草甘膦二抗溶液、草甘膦标准溶液、洗涤液、稀释液、显色液和终止液，其是以竞争性酶联免疫原理为基础，在获得草甘膦特异性抗体的基础上，利用酶联免疫反应的高效放大作用实现草甘膦的高灵敏检测，能够检测1μg/mL以下浓度的草甘膦，该试剂盒检测特异性好，灵敏度高，检测结果直观准确，操作快捷简便，改善了现有方法在样品处理、分析时间上存在的不足，以及不适宜于大批量快速筛查和推广应用的缺陷。本发明还提供了草甘膦残留的检测方法，该检测方法采用上述试剂盒实现了对草甘膦残留的高效筛查。CN107478828ACN107478828A权利要求书1/2页1.一种快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测板、草甘膦抗体溶液、草甘膦二抗溶液、草甘膦标准溶液、洗涤液、稀释液、显色液和终止液；检测板上固定有草甘膦与载体蛋白的偶联物。2.根据权利要求1所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测板，固定有草甘膦与载体蛋白的偶联物；草甘膦抗体溶液，为草甘膦兔源特异性抗体；草甘膦二抗溶液，为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体；草甘膦标准溶液；洗涤液，为PBST溶液；稀释液，含5％w/v脱脂奶的PBST溶液；显色液，为3,3',5,5'-四甲基联苯胺缓冲液；终止液，为2mol/L的盐酸溶液或硫酸溶液。3.根据权利要求1所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：检测板，固定有草甘膦与载体蛋白的偶联物；草甘膦抗体溶液，为草甘膦兔源特异性抗体；草甘膦二抗溶液，为碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体；草甘膦标准溶液；洗涤液，为PBST溶液；稀释液，含5％w/v脱脂奶的PBST溶液；显色液，为对硝基苯磷酸酯缓冲液；终止液，为2mol/L的氢氧化钠溶液。4.根据权利要求1-3任意一项所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述载体蛋白为鸡卵清蛋白；优选的，所述草甘膦标准溶液的浓度分别为2000ng/mL，1000ng/mL，500ng/mL，250ng/mL，125ng/mL，62.5ng/mL和0ng/mL。5.根据权利要求1-3任意一项所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述偶联物的制备方法包括如下步骤：(a)将2～10mg草甘膦溶解于500～2500μL磷酸盐缓冲液中，得到溶液A；(b)将2～10mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于500～2500μL磷酸盐缓冲液后，然后在搅拌的条件下，将其加入到溶液A中反应8～12min，得到溶液B；(c)将3～15mg载体蛋白溶解于1000～5000μL磷酸盐缓冲液，然后在搅拌的条件下，将其逐滴缓慢加入到溶液B中，在2～4℃避光条件下搅拌反应2.5～3.5h，然后将反应产物在磷酸盐缓冲液中透析，最后以4500～5500r/min离心4～6min取上清液，即得到偶联物。6.根据权利要求1-3任意一项所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述偶联物经碳酸盐缓冲液稀释后吸附于检测板的检测孔表面。7.根据权利要求1-3任意一项所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述草甘膦抗体溶液的制备方法包括如下步骤：2CN107478828A权利要求书2/2页(a)采用牛血清白蛋白作为载体蛋白制备免疫原；(b)选取清洁级新西兰白兔，采用颈部皮下多点注射进行免疫，免疫剂量为100～300μg/mL/只，共免疫4次，每次间隔2～4周；(c)免疫程序完成后，进行耳缘静脉或心脏采血，分离血清并采用饱和硫酸铵法提纯抗体，得到草甘膦抗体溶液。8.根据权利要求1-3任意一项所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，其特征在于，所述检测板为聚苯乙烯材质的96孔板。9.一种草甘膦残留的检测方法，其特征在于，采用权利要求1-8任意一项所述的快速检测草甘膦残留的试剂盒，包括以下步骤：(a)向检测