人型结核杆菌克隆DNA探针的制备及其应用的研究.pdf

第9卷第4期中国现代医学杂志Vol.9No.4
1999年4月ChinaJournalofModernMedicineApr.1999

人型结核杆菌克隆DNA探针的制备
及其应用的研究

解放军三0九医院结核病研究室(北京100091)吴雪琼庄玉辉黄蓉蓉

军事医学科学院分子遗传学中心黄培堂李丰生

用限制性内切酶PstⅠ消化人型结核杆菌H37RvDNA,与质粒pUC19DNA连接后转化大肠杆菌,经同
位素32P标记的人型结核杆菌H37Rv全染色体DNA探针筛选出6个阳性克隆(MT1～6),其中克隆DNA
片段MT2(4.2Kb)、MT4(3.5Kb)和MT5(3.0Kb)标记成探针,检测了22种分支杆菌标准株和15株人型结核
杆菌临床分离株以及2种非分支杆菌,其杂交结果完全相同,与人型结核杆菌及其临床分离株杂交阳性,与牛
型结核杆菌、卡介苗、堪萨斯分支杆菌、鸟分支杆菌、胃分支杆菌、龟分支杆菌和戈登分支杆菌DNA有交叉杂
交,与其它12种分支杆菌以及大肠杆菌、星状诺卡氏菌不杂交。克隆DNA探针可能成为分支杆菌分类、鉴定
的一种新工具。
关键词结核杆菌克隆DNA探针
分类号R446

分支杆菌分子生物学的研究才刚刚起步,其遗株来源于中国药品生物制品检定所;大肠杆菌和质
传背景尚不清楚。通过DNA重组技术建立基因库粒pUC19来源于军事医学科学院八所;星状诺卡氏
进而研究分支杆菌的基因图谱以及不同基因的特菌由中科院微生物研究所提供。
性,是分支杆菌分子生物学研究的重要课题。将为1.1.2工具酶碱性磷酸酶为Boehringer产品,
分支杆菌病的基因诊断和化疗打下基础。近年来,Klenow酶为NewEnglandBiolabs产品,其余均为华
国外研究者克隆、鉴定了一些分支杆菌的基因片段,美生物工程公司进口分装品。
并制备了一些克隆DNA探针,如Patel等[1]报道了1.1.3化学试剂普通琼脂糖购自华美和北京中
人型结核杆菌pMTb1(1Kb)、pMTb2(0.8Kb)和山生物技术有限公司,随机引物为Boehringer产品,
pMTb3(2.2Kb)克隆DNA的特性;Huang等[2]制备[α-32P]dATP为PromegaBiotech公司产品,其余
了堪萨斯分支杆菌pMK1～9克隆(2.2Kb)DNA探试剂为国产分析纯。
针,它只与海分支杆菌有微弱的交叉杂交;Hampson1.1.4硝酸纤维膜(孔径为0.45um)北京化工学
等[3]用付结核分支杆菌pMBr16,pMB17,pMB20和校和浙江黄岩人民化工厂产品。
pMB22四种克隆探针的指纹图谱对鸟分支杆菌复1.2方法
合体的部分血清型进行分析,将它们归为不同的1.2.1细菌培养将受试分支杆菌和非分支杆菌
RFLP型。这表明克隆DNA探针不仅可能在基因接种于适当培养基上培养。
水平对分支杆菌进行菌种鉴定,而且可通过指纹图1.2.2DNA分离、纯化收集分支杆菌菌体,悬浮
谱对分支杆菌进行菌型鉴定,其指纹图谱产生的片于2mg/ml溶菌酶溶液中,37℃孵育2h。加链霉蛋
段比总DNA探针的少,较容易辨别,有益于流行病白酶E和SDS分别至终浓度1mg/ml和1%(w/v),
学调查。本文介绍了人型结核杆菌克隆DNA探针在60℃孵育2h以上。用苯酚:氯仿抽提后,加乙醇
的制备及其在分支杆菌鉴定中的应用。离心沉淀,将沉淀溶解于适量的TE缓冲液中。质
粒pUC19DNA的分离、纯化参考Maniatis等[4]的
1材料和方法
方法。
1.1一般资料1.2.3限制性内切酶消化DNA和琼脂糖凝胶电
1.1.1菌种和质粒本研究所用分支杆菌标准菌泳限制性酶切反应按照厂家推荐的方法进行,于

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中国现代医学杂志第9卷

65℃加热5min终止反应。以EcoRⅠ和HindⅢ消段约为4.2Kb,MT4的约3.5Kb,MT5,6约3.0Kb。
化的λ-DNA为对照,消化的DNA在0.7%或Southern转移杂交证实,人型结核杆菌全染色体
1.2%的琼脂糖凝胶电泳分离后,在紫外灯下观察、DNA探针只与MT2,4,5的插入片段杂交,而不与
照相。载体pUC19DNA片段杂交。
1.2.4DNA片段的回收技术通过电洗脱法回2.2MT2,4,5克隆DNA探针的特异性
收。Bio-Rad电洗脱回收仪回收法:按厂家介绍的回收MT2,4,5重组子的插入片段,用同位素
方法进行。透析袋回收法:参照刘宗正介绍的方32P标记成探针,与22种分支杆菌标准菌株和15
法[5]。株人型结核杆菌临床分离株以及2种非分支杆菌于
1.2.5重组质粒基因库的构建及筛选用限制性37℃进行杂交。