一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108676811A(43)申请公布日2018.10.19(21)申请号201810524747.5C12R1/865(2006.01)(22)申请日2018.05.28(71)申请人郝志敏地址071001河北省保定市乐凯南大街2596号河北农业大学西校区B座2617室申请人曾凡力胡玉笑(72)发明人郝志敏曾凡力胡玉笑贾艳荣赵相东董金皋申珅(74)专利代理机构北京汇信合知识产权代理有限公司11335代理人赵倩(51)Int.Cl.C12N15/81(2006.01)C12N1/19(2006.01)权利要求书1页说明书9页序列表2页附图4页(54)发明名称一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用(57)摘要本发明公开了一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用，所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成。本发明针对酿酒酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一种酿酒酵母高效的基因无痕编辑方法。此方法不仅可以用于酿酒酵母的基因编辑，而且可以适用此基因编辑原理的其它微生物。本发明不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。CN108676811ACN108676811A权利要求书1/1页1.一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；所述的基因组同源序列A具有SEQIDNo.1的核苷酸序列；所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQIDNo.2的核苷酸序列；所述的基因组同源序列B具有SEQIDNo.3的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。3.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因组同源序列A由目的基因上游序列Ⅰ和目的基因下游序列Ⅲ组成，所述序列Ⅰ和序列Ⅲ长度为10-100bp；所述的目的基因上游序列Ⅰ具有SEQIDNo.4的核苷酸序列；所述的目的基因下游序列Ⅲ具有SEQIDNo.5的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因组同源序列B由目的基因下游序列两段连续序列Ⅱ和Ⅲ组成，所述的序列Ⅱ和序列Ⅲ长度为10-100bp；所述的目的基因下游序列Ⅱ具有SEQIDNo.6核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述载体筛选标记基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记基因、潮霉素抗性筛选标记基因Hygr、草甘膦抗性筛选标记基因Bar、natMX抗性筛选标记基因、博来霉素抗性筛选标记基因Bleomcin。6.一种所述的基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用。7.根据权利要求6所述的生物体，其特征在于：所述的生物体包括原核细胞和真核细胞。8.一种酿酒酵母基因编辑的载体及基因无痕敲除的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)构建带有Gal-CWP1序列的筛选模板质粒；(2)设计带有目的基因上游同源臂序列Ⅰ、Ⅲ为引物F，目的基因下游同源臂序列Ⅲ为引物R；(3)在模板质粒基础上扩增带有两端同源臂的Gal-CWP1片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的目的基因突变；(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经含半乳糖的丰富合成培养基平板进行筛选，通过分子内同源重组消除Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。9.根据权利要求8所述的基因编辑的载体及基因无痕敲除的过程，其特征在于：在步骤(4)中，将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经YPG合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。10.根据权利要求8所述的基因编辑的载体及基因无痕敲除的过程，其特征在于：在步骤(4)中，所述的筛选培养基为培养酵母菌的YPG培养基。2CN108676811A说明书1/9页一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用技术领域[0001]本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种基因无痕编辑的载体及其应用。背景技术[0002]酿酒酵母作为模式真菌，既具有原核生物生长迅速操作简单的特点