一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111454927A(43)申请公布日2020.07.28(21)申请号202010182038.0A61P35/00(2006.01)(22)申请日2020.03.16C12R1/42(2006.01)(71)申请人常州南京大学高新技术研究院地址213000江苏省常州市常武中路801号申请人江苏靶标生物医药研究所有限公司(72)发明人华子春李家璜韩超王萌慧周俊杰李静(74)专利代理机构江苏银创律师事务所32242代理人何红梅(51)Int.Cl.C12N9/22(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/74(2006.01)C12N15/90(2006.01)A61K35/741(2015.01)权利要求书2页说明书15页序列表5页附图6页(54)发明名称一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用(57)摘要本发明公开了一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统及其应用，本发明利用λRed重组酶促进模板DNA与基因组靶位点发生双交换，结合CRISPR/Cas9系统作为筛选手段，结合一步法同源重组快速构建打靶质粒，可实现基因的插入、替换或敲除。本发明完全根据设计同源模板替换基因组DNA，无其他片段残留。本发明可在3～4天内高效完成基因组编辑，降低实验强度，缩短实验周期。CN111454927ACN111454927A权利要求书1/2页1.一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统由双质粒CRISPR/Cas9系统构成，包含表达相关功能蛋白的辅助质粒A及表达靶位点sgRNA的打靶质粒B。2.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的辅助质粒A包含以下元件的核酸序列：Cas9蛋白、λRed重组酶、温敏型复制子、打靶质粒B复制子的sgRNA表达框和辅助质粒A筛选标记基因，其中重组酶及sgRNA为诱导表达。3.根据权利要求1所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的打靶质粒B包含以下元件的核酸序列：复制子、打靶质粒筛选标记基因、靶位点sgRNA表达框以及进行同源重组的DNA片段，所述的辅助质粒A和打靶质粒B所含有的复制子可在大肠杆菌及沙门氏菌中复制，其中质粒B的复制子及筛选标记基因应与质粒A不同，且打靶质粒B不可选用与辅助质粒A不相容的复制子。4.根据权利要求2或3所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的sgRNA表达框具有启动子-(N)X-sgRNA骨架-终止子结构，所述的靶位点DNA具有5’-(N)X-NGG-3’结构，(N)X表示X个N，N为A、T、C或T任一碱基，X为大于15小于25的自然数。5.根据权利要求4所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的靶位点DNA的X为20，所述的同源重组的DNA片段用于敲入或替换时为上游同源臂-插入片段-下游同源臂，用于敲除时为上游同源臂-下游同源臂，该DNA片段构建在打靶质粒B中或PCR产物中；所述基因编辑系统可同时对多个靶位点进行基因编辑。6.根据权利要求5所述的沙门氏菌高效无痕基因编辑系统，其特征在于：所述的打靶质粒B包含多个靶位点的编辑模块，结构为质粒骨架(抗性基因-复制子)-编辑模块1(靶位点1sgRNA表达框-上游同源臂1-敲入(或替换)片段-下游同源臂1)-编辑模块2(靶位点2sgRNA表达框-上游同源臂2-敲入(或替换)片段-下游同源臂2)-编辑模块n；但随着靶位点增多，编辑成功率逐渐下降，且考虑质粒构建的时间成本，不超过3个靶位点。7.一种打靶质粒B的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)用于敲入(或替换)时：分别扩增打靶质粒B骨架，靶位点sgRNA表达框，上/下游同源臂，敲入(或替换)片段，使用一步法同源重组连接所有DNA片段；(2)用于敲除时：分别扩增打靶质粒B骨架，靶位点sgRNA表达框，上/下游同源臂，使用一步法同源重组连接所有DNA片段；(3)打靶质粒B也可不包含同源臂，上/下游同源臂单独扩增连接作为线性DNA模板。8.一种沙门氏菌高效无痕基因编辑系统在基因组编辑中的应用方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将辅助质粒A导入沙门氏菌，诱导λRed重组酶表达，制备感受态细胞；(2)向步骤(1)所述感受态细胞导入打靶质粒B及线性DNA模板；或导入包含模板DNA的打靶质粒B；(3)将步骤(2)的细胞复苏后涂布平板，该平板含有质粒A及B对应的两种抗性，筛选发生了双交换的阳性克隆；(4)将对阳性克隆进行PCR或测序验证后，诱导打靶质粒B复制子的sgRNA表达，去除所含质粒B；(5)验证去除质粒B后，提高细菌培养温度，去除质粒A，获得改造成功的沙门氏菌克隆。2CN111454927A