一种用于对目标基因无痕编辑的载体及其构建与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114990149A(43)申请公布日2022.09.02(21)申请号202210653609.3C12R1/645(2006.01)(22)申请日2022.06.10(71)申请人山东大学地址266237山东省青岛市即墨滨海路72号(72)发明人宋欣李越秦玉琪(74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221专利代理师李健康(51)Int.Cl.C12N15/81(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/65(2006.01)C12N1/19(2006.01)C12N15/31(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表5页附图2页(54)发明名称一种用于对目标基因无痕编辑的载体及其构建与应用(57)摘要本发明公开了一种在酵母中用于对目标基因无痕编辑的质粒载体PICZαHU，是以pPICZαA为出发载体连接完整的潮霉素抗性基因hph表达盒和完整的反向筛选标记基因upp表达盒构建获得，该质粒载体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明还公开了所述质粒载体在球拟假丝酵母中基因组精简的基因组岛片段敲除中的应用。实验证实目的片段的删除不影响球拟假丝酵母生产槐糖脂的性能，证明了本发明所述无痕编辑质粒PICZαHU的可操作性和稳定性，具有良好的应用前景。CN114990149ACN114990149A权利要求书1/1页1.一种在酵母中用于对目标基因无痕编辑的质粒载体，其特征在于：所述质粒载体命名为PICZαHU质粒载体，是以pPICZαA为出发载体连接完整的潮霉素抗性基因hph表达盒和完整的反向筛选标记基因upp表达盒构建获得，该质粒载体的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利1所述的在酵母中用于对目标基因无痕编辑的质粒载体，其特征在于：所述酵母是球拟假丝酵母(Starmerellabombicola)。3.权利1所述在酵母中用于对目标基因无痕编辑的质粒载体的构建方法，步骤是：(1)将潮霉素抗性基因hph表达盒通过BamHΙ限制性酶切位点连入出发载体pPICZαA，得到质粒命名为pPICZαA‑hph；(2)将反向筛选标记基因upp表达盒与制得的质粒pPICZαA‑hph通过限制性内切酶SalΙ进行连接，得到重组质粒，命名为PICZαHU质粒载体。4.权利要求1或2所述在酵母中用于对目标基因无痕编辑的质粒载体在球拟假丝酵母中基因组精简的基因组岛片段敲除中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述基因组精简的目标基因组岛片段是k1基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于应用方法是：(1)构建k1基因片段敲除载体：用PCR扩增得到如SEQIDNo.2所示核苷酸序列的k1片段的上下游同源臂并通过两个限制性内切酶BglII，XbaI连接到质粒PICZαHU，得到重组质粒命名为PICZαHU‑k1；(2)构建球拟假丝酵母基因组岛片段k1的敲除菌株：将k1基因片段敲除载体PICZαHU‑k1通过电转化的方法转化入出发菌株球拟假丝酵母Δupp::six中，使用潮霉素抗性筛选得到发生第一次单交换的重组子；重组子在含有5‑FU培养基再次筛选得到经过第二次交换的目的基因k1片段敲除且不含任何外源基因片段的敲除菌株，该菌株即为基因片段k1被敲除的基因组岛敲除菌株，命名为球拟假丝酵母(Starmerellabombicola)Δk1。7.一种球拟假丝酵母基因组岛片段k1敲除菌株，其特征在于：所述菌株中携带k1敲除载体PICZαHU‑k1，其中所述k1基因片段的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。2CN114990149A说明书1/8页一种用于对目标基因无痕编辑的载体及其构建与应用技术领域[0001]本发明涉及一种用于真菌中基因改造的载体，尤其涉及一种在酵母中用于对目标基因无痕编辑的PICZαHU质粒载体及其构建与应用。属于基因工程技术领域。背景技术[0002]为了更为有效地得到基因突变菌株，通常选用具有抗生素性质的耐受基因作为标记进行筛选。但是，由于过多抗性标记的插入，不仅有可能会影响菌株自身基因的正常表达，还有可能影响其正常生长。因此，将反向筛选标记应用于无痕基因敲除系统中成为解决上述问题的一种有效方法。反向筛选标记原本是存在于某些微生物中的特殊基因，其主要特点是当染色体中含有这些筛选标记的基因并存在激活表达条件时，细胞将会发生非自然性死亡，反之，发生重组突变的菌株则可以正常生长。常用的反向筛选基因有SacB，rpsL，upp，mazF，araR等。[0003]upp基因编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracilphosphoribosyltransferase,UPRTase)，该酶作