大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115058446A(43)申请公布日2022.09.16(21)申请号202210164472.5(22)申请日2022.02.22(71)申请人中国农业科学院作物科学研究所地址100081北京市海淀区中关村南大街12号(72)发明人胡正姜奇彦孙现军张辉陈向前牛风娟(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245专利代理师张羽(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N15/66(2006.01)C12N15/55(2006.01)权利要求书2页说明书17页序列表13页附图3页(54)发明名称大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用(57)摘要本发明公开了大豆多基因编辑表达载体及其构建方法与应用。该大豆多基因表达载体包括至少2个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒中的sgRNA靶序列识别区对应不同靶基因；每个所述sgRNA表达盒中的大豆U6启动子不同。该大豆多基因编辑表达载体不仅可以补充大豆多基因编辑的方法，同时可以有效的提高编辑效率。CN115058446ACN115058446A权利要求书1/2页1.一种大豆多基因编辑表达载体，其特征在于，包括至少2个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区；每个所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒中的sgRNA靶序列识别区对应不同靶基因；每个所述sgRNA表达盒中的大豆U6启动子不同。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述大豆U6启动子为GmU6‑2、GmU6‑8、GmU6‑10和GmU6‑11中任一种。3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区编码序列为SEQIDNo.2的第1548‑1624位所示。4.根据权利要求1‑3任一所述的载体，其特征在于：所述大豆多基因编辑表达载体包括4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件；所述4个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒串联形成的多基因编辑元件为如下四种表达盒任意组合方式串联形成：1)包括大豆U6启动子GmU6‑2、sgRNA靶序列识别区A和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；2)包括大豆U6启动子GmU6‑8、sgRNA靶序列识别区B和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；3)包括大豆U6启动子GmU6‑10、sgRNA靶序列识别区C和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；4)包括大豆U6启动子GmU6‑11、sgRNA靶序列识别区D和Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区的sgRNA表达盒；所述sgRNA靶序列识别区A、B、C和D分别结合不同靶基因。5.根据权利要求1‑4任一所述的载体，其特征在于：所述大豆多基因编辑表达载体的核苷酸序列包括SEQIDNo.14或SEQIDNo.15所示序列。6.一种制备权利要求1‑5任一所述载体的方法，其特征在于：包括采用同尾酶将权利要求1‑5任一所述载体中不同大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒进行串联，得到所述载体。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：1)制备表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体组，所述载体组由多个表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体组成，所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体依次包括限制性内切酶A酶切识别位点、大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒和限制性内切酶B酶切识别位点，所述大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒依次包括大豆U6启动子、sgRNA靶序列识别区、Cas9蛋白结合的sgRNAscaffold区和限制性内切酶C酶切识别位点，所述限制性内切酶A和所述限制性内切酶C为同尾酶；2)用限制性内切酶A和限制性内切酶B对所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体分别酶切，收集不同的大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒；2CN115058446A权利要求书2/2页3)用限制性内切酶B和限制性内切酶C对1个所述表达大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒的载体酶切，收集载体骨架，再2)获得的1个大豆U6启动子表达的sgRNA表达盒与所述载体骨架连接，得到连