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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115927447A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202211017495.XC12N15/65(2006.01)(22)申请日2022.08.23C12N15/113(2010.01)C12N15/55(2006.01)(71)申请人广东省农业科学院果树研究所A01H5/00(2018.01)地址510000广东省广州市天河区五山大A01H6/00(2018.01)丰二街80号申请人岭南现代农业科学与技术广东省实验室(72)发明人毕方铖胡春华窦同心刘范杨乔松易干军(74)专利代理机构北京慕达星云知识产权代理事务所(特殊普通合伙)11465专利代理师田立媛(51)Int.Cl.C12N15/84(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表20页附图3页(54)发明名称一种无转基因残留基因编辑载体、构建方法及应用(57)摘要本发明公开了一种无转基因残留基因编辑载体,载体由FLP表达载体、Cas9表达盒和gRNA表达盒重组连接,具体为pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos_pMaU6c:dBasI:esgRNA。本发明的基因编辑载体具有编辑效率高、外源转基因成分删除效率高、易检测,将其应用于植株编辑中,无需外源处理在胚再生阶段即可实现外源成分的删除。CN115927447ACN115927447A权利要求书1/1页1.一种无转基因残留基因编辑载体,其特征在于,所述载体由FLP表达载体、Cas9表达盒和gRNA表达盒重组连接,具体为pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos_pMaU6c:dBasI:esgRNA。2.权利要求1所述的一种无转基因残留基因编辑载体的构建方法,其特征在于,过程包括:1)以pLF_polseed‑FLP载体为基础,以合成水稻REG2启动子序列替换pLF_polseed‑FLP载体中的PAB5启动子,得到pLF_pREG2‑FLP载体;2)合成Ubi:MaCas9:Nos,并克隆进pLF_pREG2‑FLP载体,得到pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos载体;3)扩增pMaU6c:dBasI:esgRNA序列,克隆进pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos,得到pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos_pMaU6c:dBasI:esgRNA载体。3.权利要求1所述的无转基因残留基因编辑载体在选育无基因残留基因编辑植株中的应用。4.一种获得无转基因残留基因编辑植株的方法,其特征在于,包括下述过程:1)在所述pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos_pMaU6c:dBasI:esgRNA基因编辑载体上引入需突变基因的靶位点,利用农杆菌介导的方法进行遗传转化;2)在获得的再生植株中先用GUS染色进行初步鉴定,进一步用PCR的方法筛选鉴定出无转基因残留且在特定位点发生基因编辑突变的植株。5.一种基因编辑表达元件,其特征在于,包括基因编辑载体pLF_pREG2‑FLP_Ubi:MaCas9:Nos_pMaU6c:dBasI:esgRNA。2CN115927447A说明书1/7页一种无转基因残留基因编辑载体、构建方法及应用技术领域[0001]本发明涉及基因编辑技术领域,更具体地说是涉及一种无转基因残留基因编辑载体、构建方法及应用。背景技术[0002]基因组编辑技术特别是基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术已广泛应用于动植物的基因的功能和分子育种工作。CRISPR/Cas9的基因组编辑主要由Cas9蛋白与sgRNA(single‑guideRNA)组成,靶位点通常由20碱基的碱基序列构成,靶点的3′端连有PAM序列,Cas9蛋白的PAM序列为NGG,N为任意碱基。Cas9蛋白与gRNA结合后,先识别基因组PAM序列,然后通过gRNA与靶序列DNA链互补配对,完成靶位点的定位过程,定点后Cas9蛋白在离PAM序列3‑4碱基的位置进行切割靶点DNA的两条链,从而形成DSB结构,然后细胞启动自我修复机制,在DNA切口处产生碱基丢失、插入或替换,造成基因的突变,实现对目的基因精确的编辑。[0003]目前在香蕉中基于香蕉胚性悬浮系,已建立了较为高效的农杆菌介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,且针对香蕉中遇到的产业问题,创制了多种基因编辑新种质,但由于通常所操作的对象是主栽三倍体香蕉,外源引入的转基因成分很难像其他作物一样通过杂交或自交的方式去除掉,存在转基因生物安全问题,严重制约了进一步推广应用。目前在香蕉中还未见无转基因残留CRISPR/Cas9基因编辑技术体系建立的报道。[0004]因此,提供一种无转基因残留CRISPR‑Cas9