间充质干细胞的分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110592005A(43)申请公布日2019.12.20(21)申请号201910749522.4(22)申请日2019.08.14(71)申请人广州乾晖生物科技有限公司地址510285广东省广州市海珠区南边路38号大院自编7号102房(72)发明人高毅易笑陈枫李阳(74)专利代理机构北京市立方律师事务所11330代理人刘延喜(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书2页说明书6页附图5页(54)发明名称间充质干细胞的分离方法(57)摘要本申请提供了一种间充质干细胞的分离方法，包括如下步骤：取完整的人源胎盘组织，从所述胎盘组织的脐静脉灌入清洗灌注液直至流出胎盘组织的清洗灌注液呈无色；将所述胎盘组织封闭处理以使所述胎盘组织内部形成不渗漏的灌注空间，从所述胎盘组织的脐静脉灌入酶灌注液进行消化；收集并培养所述酶灌注液中包含间充质干细胞的第一目标细胞；将所述第一目标细胞培养至对数生长期，保留1/3的所述第一目标细胞的游离细胞进行传代培养，以扩增所述间充质干细胞。本申请能够大大提高间充质干细胞的分离产量。CN110592005ACN110592005A权利要求书1/2页1.一种间充质干细胞的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：取完整的人源胎盘组织，从所述胎盘组织的脐静脉灌入清洗灌注液直至流出胎盘组织的清洗灌注液呈无色；将所述胎盘组织封闭处理以使所述胎盘组织内部形成不渗漏的灌注空间，从所述胎盘组织的脐静脉灌入酶灌注液进行消化；收集并培养所述酶灌注液中包含间充质干细胞的第一目标细胞；将所述第一目标细胞培养至对数生长期，保留1/3的所述第一目标细胞的游离细胞进行传代培养，以扩增所述间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，在灌入清洗灌注液之前，还包括：将所述胎盘组织充分洗净以除去表面的血污。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述清洗灌注液的灌注速度为100-150ml/min，所述清洗灌注液的体积为3-5L。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述清洗灌注液为D-Hank's、磷酸缓冲盐溶液和生理盐水中的至少一种。5.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述将所述胎盘组织封闭处理的步骤为：采用半透膜将所述胎盘组织包裹进行封闭。6.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述将所述胎盘组织封闭处理的步骤为：将所述胎盘组织中羊膜的出口封闭。7.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述酶灌注液的灌注速度为80-100ml/min，所述酶灌注液的灌注时间为1-2h，所述灌入酶灌注液的过程在恒温条件下进行。8.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述酶灌注液包含胶原酶和胰蛋白酶，所述胶原酶的用量为0.5-5.0mg/ml，所述胰蛋白酶的用量为0.5-5.0％。9.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述收集并培养所述酶灌注液中包含间充质干细胞的第一目标细胞的步骤包括：接种时调整所述第一目标细胞的密度至8×107～2×108个/L，进行静置培养。10.根据权利要求1所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述从所述胎盘组织的脐静脉灌入酶灌注液进行消化的步骤之后，还包括：将消化后的所述胎盘组织进行静置培养，得到包含间充质干细胞的第二目标细胞。11.根据权利要求10所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述将消化后的所述胎盘组织静置培养的步骤，包括：从所述胎盘组织中分别取以下组织块进行静置培养：脐带、羊膜、绒毛膜平滑肌层、绒毛膜滋养层和蜕膜组织。12.根据权利要求11所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述静置培养的步骤包括：将所述组织块进行预处理，并将预处理后的所述组织块放置于培养器皿底面进行平铺，沿培养器皿边缘加入培养基直至没过所述组织块。13.根据权利要求12所述的间充质干细胞的分离方法，其特征在于，所述将消化后的所述胎盘组织静置培养的步骤，还包括：2CN110592005A权利要求书2/2页当培养器皿中的细胞生长至对数生长期，用胰酶进行消化得到包含所述间充质干细胞的第二目标细胞。3CN110592005A说明书1/6页间充质干细胞的分离方法技术领域[0001]本申请涉及干细胞领域，具体而言，本申请涉及一种间充质干细胞的分离方法。背景技术[0002]间充质干细胞存在于多种组织，具有向成脂、成骨、成软骨、成脂肪、成神经，骨髓基质甚至肝脏细胞等多种分化潜能的干细胞，是细胞治疗、组织工程研究中一种重要的种子细胞和基因治疗载体。其临床转化应用已成为研究热点，其中如何大