牙龈间充质干细胞的原代分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106244533A(43)申请公布日2016.12.21(21)申请号201610873021.3(22)申请日2016.09.30(71)申请人广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司地址510000广东省广州市开发区广州国际生物岛螺旋四路一号生产区第五层502单元(72)发明人陈海佳王一飞葛啸虎林正梅戚康艺(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书1页说明书8页附图5页(54)发明名称牙龈间充质干细胞的原代分离方法(57)摘要本发明涉及细胞领域，特别涉及牙龈间充质干细胞的原代分离方法。本发明采用二次消化法，在第一次酶解的基础上，对仍未消化的组织块，采用胰蛋白酶进行第二次酶解，提高了细胞的收获率，减少细胞丢失。本发明使用的GMSCs完全培养基不含有动物源血清，避免了引入污染和过敏原的风险，与常规使用的含胎牛血清细胞培养基相比具有更高的临床安全性。CN106244533ACN106244533A权利要求书1/1页1.一种牙龈间充质干细胞的原代分离方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：获得牙龈组织，漂洗；步骤2：取步骤1获得的漂洗后的牙龈组织，剪碎后与消化酶组合物混合后消化，洗涤，收集细胞；步骤3：取步骤2中过滤后的未消化的牙龈组织与胰蛋白酶混合后消化，离心，洗涤，收集细胞；步骤4：取步骤2获得的细胞与步骤3获得细胞混合，用培养基重悬后培养，纯化；步骤2中所述消化酶组合物为Ⅰ型胶原酶-Dispase酶混合消化液。2.根据权利要求1所述的原代分离方法，其特征在于，步骤2中所述消化酶组合物与牙龈组织的体积比为1:1～5:1。3.根据权利要求1或2所述的原代分离方法，其特征在于，步骤2中所述消化酶组合物中Ⅰ型胶原酶与Dispase酶的体积比为1:1～1:5；所述消化酶组合物中Ⅰ型胶原酶的浓度为3g/L，Dispase酶的浓度为4g/L。4.根据权利要求1至3任一项所述的原代分离方法，其特征在于，步骤2中Ⅰ型胶原酶的酶活为≥250U/mg，Dispase酶的酶活为≥0.8U/mg。5.根据权利要求1至4任一项所述的原代分离方法，其特征在于，步骤3中所述胰蛋白酶与牙龈组织的体积比为1:1～1:5。6.根据权利要求1至5任一项所述的原代分离方法，其特征在于，步骤3中所述胰蛋白酶的质量浓度为0.125％，胰蛋白酶的酶活为≥250U/mg。7.根据权利要求1至6任一项所述的原代分离方法，其特征在于，步骤4中培养基为添加表皮生长因子的间充质干细胞无血清培养基。8.根据权利要求7所述的原代分离方法，其特征在于，所述培养基中所述表皮生长因子的浓度为1～20ng/mL。9.根据权利要求1至8任一项所述的原代分离方法，其特征在于，步骤2中所述消化为于37℃，200R消化45min；步骤3中所述消化为于37℃，200R消化15min。10.根据权利要求1至9任一项所述的原代分离方法，其特征在于，步骤2或步骤3中所述洗涤为离心，重悬细胞，过滤，收集悬液，离心后收集细胞；所述离心为1000r/min离心5min。2CN106244533A说明书1/8页牙龈间充质干细胞的原代分离方法技术领域[0001]本发明涉及细胞领域，特别涉及牙龈间充质干细胞的原代分离方法。背景技术[0002]间充质干细胞是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等从骨髓中发现的。大量研究发现，间充质干细胞不仅可以分化为多种间质组织的细胞，如骨、脂肪、软骨、肌肉、肌腱和韧带等。同时在一定的诱导条件下还可以横向分化为外胚层和内胚层细胞。如上皮细胞、神经元细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞、表皮干细胞等。目前研究表明，间充质干细胞来源十分广泛，除骨髓外，脂肪、脐带华通胶、胎盘、羊膜、肌肉、韧带等均已分离培养出。近年来大量研究证明人体和动物的颅颌面部，特别是牙源性组织中存在具有特殊分化和再生功能的间充质干细胞。近年来因其在组织工程和细胞替代治疗的临床前研究而备受关注。[0003]在牙科学领域的研究中，牙髓、牙周膜、颌骨、根尖牙乳头等成体颌面组织中的牙源性间充质干细胞具有强大的组织再生能力，在一系列研究中展现了缺损修复再生的良好应用前景。如牙周膜干细胞等表现出对免疫细胞活性的调节作用。牙龈作为牙周组织的屏障，对机体状态、口腔环境变化很敏感，容易产生增生等诸多疾病表型，而且牙龈本身具有强大的愈合能力，这些现象暗示牙龈组织中可能存在对组织动态平衡和损伤修复具有重要作用的未分化间充质干细胞。[0004]牙龈属于牙周组织，是附于牙齿周围的分隔下方牙周组织和外部空间的粘膜屏障。牙龈包括上皮和固有