胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112608893A(43)申请公布日2021.04.06(21)申请号202011568941.7(22)申请日2020.12.25(71)申请人博雅干细胞科技有限公司地址214092江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号博雅干细胞公司(72)发明人王正刘冰肖海蓉汤乐(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书2页说明书18页附图1页(54)发明名称胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法(57)摘要本发明涉及胎盘间充质干细胞的分离和纯化方法。具体涉及用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM‑F12培养基为基质配制并包含：血小板裂解物、人血白蛋白、重组胰岛素、EGF等等。分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中在分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段使用原代完全培养基培养得到原代胎盘间充质干细胞，P0代及后续的代次使用传代完全培养基培养细胞得到P1至P10代的间充质干细胞。本发明方法呈现如说明书所述优异效果，尤其是通过使用无血清的培养基获得高收率且高活率的间充质干细胞。CN112608893ACN112608893A权利要求书1/2页1.用于传代培养胎盘间充质干细胞的培养基，其是以DMEM‑F12培养基为基质配制并包含：2.5％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、8ng/ml的EGF、12ng/ml的bFGF、0.04％硫代甘油、1％果糖。2.根据权利要求1的培养基，所述DMEM‑F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L‑亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L‑赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L‑蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L‑苯丙氨酸35.48mg、1,4‑丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L‑丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L‑苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L‑丙氨酸4.45mg、D‑泛酸钙2.24mg、氯化钠7000mg、L‑天门冬酰胺7.5mg、氯化胆碱8.98mg、无水磷酸二氢钠54.35mg、L‑天门冬氨酸6.65mg、叶酸2.65mg、磷酸氢二钠71.02mg、L‑半胱氨酸盐酸盐17.56mg、i‑肌醇12.6mg、七水硫酸锌0.432mg、L‑谷氨酸7.35mg、烟酰胺2.02mg、L‑精氨酸盐酸盐147.5mg、L‑脯氨酸17.25mg、盐酸吡哆醛2mg、L‑胱氨酸盐酸盐31.29mg、L‑色氨酸9.02mg、盐酸吡哆醇0.031mg、L‑谷氨酰胺365mg、L‑酪氨酸38.4mg、核黄素0.219mg、甘氨酸18.75mg、L‑缬氨酸52.85mg、盐酸硫胺2.17mg、L‑组氨酸盐酸盐31.48mg、D‑葡萄糖3151mg、胸苷0.365mg、L‑异亮氨酸54.47mg、次黄嘌呤2mg、维生素B12为0.68mg、水适量加至1000mL。3.根据权利要求2的培养基，所述DMEM‑F12培养基的配制方法为：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。4.分离和传代培养胎盘间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞和(b)传代培养胎盘间充质干细胞两个阶段，其中(a)分离培养原代胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：(a1)在生物安全柜中处理经2‑8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；(a2)使用D‑Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，并剪碎至0.25±0.05cm2大小，D‑Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；(a3)消化结束后，加一倍体积D‑hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；(a5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D‑hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D‑hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞(即P0代)；(b)传代培养胎盘间充质干细胞的阶段包括如下步骤：(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一