间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111011363A(43)申请公布日2020.04.17(21)申请号201911294234.0(22)申请日2019.12.16(71)申请人广东唯泰生物科技有限公司地址528200广东省佛山市南海区桂城夏南路61号创越时代文化创意园一座8层(72)发明人孙灿兴李静静赵蓝刘小翠江嘉豪(74)专利代理机构广州新诺专利商标事务所有限公司44100代理人许英伟(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)C12N5/0775(2010.01)权利要求书2页说明书5页附图2页(54)发明名称间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法(57)摘要本发明提供一种间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法，涉及细胞生物学技术领域。该间充质干细胞冻存液，包括以下工作浓度的组分：间充质干细胞培养上清液25～35mL/100mL，甘油4～6mL/100mL，聚乙烯吡咯烷酮4～6g/100mL，聚乙烯醇0.5～1.5g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，羟基磷灰石纳米颗粒1～2.5g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL，血清替代物8～12mL/100mL；所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。本发明的冻存液能有效减少细胞在冻存和复苏过程中受到的损伤，提高复苏后细胞活性。CN111011363ACN111011363A权利要求书1/2页1.一种间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括以下工作浓度的组分：所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述羟基磷灰石纳米颗粒的工作浓度为1.8～2.2g/100mL。3.根据权利要求1所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞冻存液的基底液为间充质干细胞选择性培养基。4.根据权利要求3所述的间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述间充质干细胞选择性培养基为干细胞无血清培养基。5.一种间充质干细胞冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：消化：将培养汇合度为75％～85％的间充质干细胞取出，清洗，消化，离心，保留沉淀，加入权利要求1～3任一项所述的间充质干细胞冻存液，重悬得细胞悬液，细胞液浓度为4.5～5.5×106个/mL；冻存：使用程序降温仪将上述细胞悬液降温至-80℃，放置于液氮保存。6.一种间充质干细胞的保存试剂盒，其特征在于，包括复苏液和权利要求1～3任一项所述的间充质干细胞冻存液。7.根据权利要求6所述的保存试剂盒，其特征在于，所述复苏液包括以下工作浓度的组分：所述间充质干细胞培养上清液通过以下方法制备得到：78～82％汇合度下的间充质干细胞培养22～26h，过滤，保留滤液，即得间充质干细胞培养上清液。8.根据权利要求7所述的保存试剂盒，其特征在于，所述复苏液的基底液为无血清培养基。9.一种间充质干细胞的复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：解冻：取采用权利要求1～3任一项所述的间充质干细胞冻存液进行冻存的细胞，放置于37±0.5℃下解冻；2CN111011363A权利要求书2/2页离心：向解冻的细胞液中加入权利要求7或8所述的复苏液，离心，保留沉淀，加入复苏液重悬，接种，培养。10.根据权利要9所述的复苏方法，其特征在于，所述离心步骤具体为：向解冻的细胞液中加入解冻后细胞液4～6倍体积的复苏液，300g离心4～6min，保留沉淀，加入复苏液重悬，接种至培养瓶，放置于培养箱中培养。3CN111011363A说明书1/5页间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法技术领域[0001]本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种间充质干细胞冻存液、冻存方法、保存试剂盒和复苏方法。背景技术[0002]冷冻保护液(Cryoprotectant)是指可以保护细胞在极低温的环境中免受冻伤的物质，也称为细胞冻存液。在细胞悬液中加入冷冻保护剂可以保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤。冷冻保护剂同溶液中的水分子结合，发生水合反应，弱化水的结晶，使溶液的粘性增加从而减少冰晶的形成，同时可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤。[0003]根据是否可以穿透细胞膜，冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。渗透性冷冻保护剂多为小分子物质，可以透过细胞膜渗透到细胞内，该类保护剂主要有二甲基亚砜，甘油，乙二醇等，其保护机制是在细胞悬液凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩