脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112075418A(43)申请公布日2020.12.15(21)申请号202011057613.0(22)申请日2020.09.29(71)申请人广州同康生物科技有限公司地址511356广东省广州市经济技术开发区永和经济区禾丰路59号(72)发明人张印(74)专利代理机构广州科沃园专利代理有限公司44416代理人黄健仪(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书8页(54)发明名称脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法(57)摘要本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份，L‑岩藻糖2～6份，硫辛酸1～5份，还原型谷胱甘肽0.1～2份。本发明提供的脂肪间充质干细胞冻存液不含有动物血清，安全性高，成本低，且制备方法简单，与常规的冻存方法相比，采用本发明脂肪间充质干细胞的冻存方法冻存的细胞可明显减少冻存液对细胞的损伤，复苏后细胞回收率高。CN112075418ACN112075418A权利要求书1/1页1.一种脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，包括如下组分及其重量份数组成：基础培养基80～120份、低温保护剂5～10份、L-岩藻糖2～6份、硫辛酸1～5份和还原型谷胱甘肽0.1～2份。2.如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，由如下组分及其重量份数组成：基础培养基100份、低温保护剂8份、L-岩藻糖3份、硫辛酸3份和还原型谷胱甘肽1.5份。3.如权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述基础培养基为Lonza基础培养基或DMEM基础培养基。4.如权利要求1或2所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比10～16:9～13:2～6组成。5.如权利要求4所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的茯苓提取物的制备步骤如下：取茯苓粉碎后，加入其重量7～12倍的体积份数为60～80％乙醇水溶液浸泡3～5小时，然后在50～70℃下提取1～3次，每次提取时间为1～3小时，过滤，将滤液合并，将合并液减压浓缩、真空干燥，即得茯苓提取物；所述的裂褶菌多糖的制备步骤如下：向裂褶菌菌丝粉中加入其重量15～20倍的水浸泡1～3小时，然后加热到90℃，回流提取1～2小时，过滤得到一次滤液，得到滤液和滤渣；向滤渣中加入其重量10～15倍体积的蒸馏水继续回流1～2小时，滤过得到二次滤液，将一次滤液和二次滤液合并；真空浓缩至原体积的1/10～1/30，再加入3～6倍体积的70～80％乙醇混合均匀，静置3～5小时，3000～5000rpm下离心10min，弃上清液，将沉淀在60～80℃下烘干至恒重，即得裂褶菌多糖。6.如权利要求4所述的脂肪间充质干细胞冻存液，其特征在于，所述的低温保护剂由硫酸乙酰肝素、茯苓提取物和裂褶菌多糖按重量比13:10:4组成。7.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，采用权利要求1至6中任一项所述的脂肪间充质干细胞冻存液进行冻存。8.如权利要求7所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将低温保护剂，L-岩藻糖，硫辛酸和还原型谷胱甘肽溶解于基础培养基中，用细菌滤器过滤除菌，得脂肪间充质干细胞冻存液；S2、取临床上人体腹部皮下脂肪组织，经PBS浸泡，清洗，离心，沉淀，得脂肪间充质干细胞；S3、将步骤S2所得脂肪间充质干细胞加入步骤S1所得的脂肪间充质干细胞的冻存液中，制成细胞悬液；S4、将步骤S3所得的细胞悬液进行程序性降温预冻存，预冻完成后转移至液氮中保存。9.如权利要求8所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤S3中细胞悬液中的细胞密度为1×105～107个/mL。10.如权利要求8所述的脂肪间充质干细胞的冻存方法，其特征在于，所述步骤S4中程序性降温预冻存的过程为：先在-20～-30℃下预冻2～3h；然后以1～4℃/min的速率的温度降至-70～-80℃，继续预冻3～5h。2CN112075418A说明书1/8页脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法技术领域[0001]本发明属于干细胞技术领域，具体涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液以及脂肪间充质干细胞冻存方法。背景技术[0002]间充质干细胞(MSC，MesenchymalStemCells)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSCs最初在骨髓中发现，是多能干细胞，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调