一种绒毛膜间充质干细胞冻存液.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109105364A(43)申请公布日2019.01.01(21)申请号201811189416.7(22)申请日2018.10.12(71)申请人希瑞干细胞科技有限公司地址214000江苏省无锡市解放南路727号富安大厦第15层屋(72)发明人费方利王浩(74)专利代理机构无锡市汇诚永信专利代理事务所(普通合伙)32260代理人张欢勇(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种绒毛膜间充质干细胞冻存液(57)摘要本发明涉及一种绒毛膜间充质干细胞冻存液及其制备方法，其原料按体积百分比包括：二甲基亚砜10％-20％，人血白蛋白20％-70％，绒毛膜间充质干细胞条件培养基10％-60％。本发明的冻存液使绒毛膜间充质干细胞冻存效果良好，可以保持绒毛膜间充质干细胞90％以上活率和95％回收率一年以上，大大提高了绒毛膜间充质干细胞的复苏后的增殖速率；同时检测细胞表型时，复苏后的干细胞高效表达CD90、CD73、CD105，符合绒毛膜间充质干细胞表型特征。CN109105364ACN109105364A权利要求书1/1页1.一种绒毛膜间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采集胎盘样本，在24小时内对胎盘样本进行处理，将胎盘样本上绒毛膜组织剪切并进行消化，消化液为0.25％胰酶-EDTA，消化液与绒毛膜体积比为1:4-1:1，消化时间30-60分钟，消化后用100微米滤网进行过滤，将消化、过滤后的细胞接种至T75培养瓶中培养；(2)每隔3-4天，对T75培养瓶中的细胞用无血清完全培养基进行换液，待细胞融合率至75-90％时进行传代，弃去培养液上清，用生理盐水清洗细胞2遍，再向细胞中加入3ml的0.25％胰酶-EDTA，消化3分钟，用5倍消化液体积的完全培养基终止消化，1500rpm条件下离心5分钟，收集细胞接种于含完全培养基的培养瓶中，接种密度为3000-8000/cm2；(3)传代至P2-P5代后，细胞连续培养24-96小时后，收集培养上清液，将上清液转移入无菌离心管中，在1000-1500rpm条件下，离心5-10分钟，去除沉淀，或者将上清液通过70微米滤网过滤，获得滤液，获得绒毛膜间充质干细胞条件培养基；(4)将二甲基亚砜，人血白蛋白，所述绒毛膜间充质干细胞条件培养基分别按照体积百分比10％-20％、20％-70％、10％-60％混匀，获得绒毛膜间充质干细胞冻存液。2.根据权利要求1所述的一种绒毛膜间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述二甲基亚砜、人血白蛋白、绒毛膜间充质干细胞条件培养基分别按照体积百分比10％、40％、50％混匀制成绒毛膜间充质干细胞冻存液。3.根据权利要求1所述的一种绒毛膜间充质干细胞冻存液的制备方法，其特征在于：所述绒毛膜间充质干细胞是人绒毛膜间充质干细胞。4.一种绒毛膜间充质干细胞冻存液，其特征在于：根据权利要求1所述的方法制备的绒毛膜间充质干细胞冻存液。2CN109105364A说明书1/4页一种绒毛膜间充质干细胞冻存液技术领域[0001]本发明涉及干细胞冻存技术领域，尤其涉及一种绒毛膜间充质干细胞冻存液及其制备方法。背景技术[0002]绒毛膜间充质干细胞(chorion-derivedmesenchymalstemcells，CDMSC)是从胎盘绒毛膜组织中分离出来的干细胞。胎盘是妊娠期存在的特殊器官，对胚胎起着屏障，营养、呼吸、排泄和免疫等作用，同时还有一定的内分泌功能，是维系妊娠和胎儿生长发育的重要器官。胎盘来源的间充质干细胞较骨髓来源的干细胞有更强的增殖活性和更长的生存时间，同时取材方便、来源广、易分离培养。在组织工程、干细胞移植、基因治疗等领域具有广阔的应用前景。[0003]人绒毛膜间充质干细胞(hunmanchorion-derivedmesenchymalstemcells，hCDMSC)潜在的存储和医疗价值广阔，低温冻存是保存人绒毛膜间充质干细胞的重要方法，而其种子库细胞的长期活性与冻存坏境有密切关系，冻存液的微环境对人绒毛膜间充质干细胞有着重要影响，当细胞微环境出现变化的时候可直接影响干细胞的形态、增殖、分化、凋亡和衰老，且细胞的生物学特性和遗传稳定性都可能发生变化。[0004]目前现有技术中，间充质干细胞的细胞冻存保护液配方一种是以DMSO(二甲基亚砜)和血清为主要成分，另一种是以培养基、DMSO和血清为主要成分。此外还有一些配方是在上述两种配方的基础上添加其他保护细胞的物质。但上述配方冻存绒毛膜间充质干细胞均效果不理想，复苏后细胞回收率及细胞活率低。发明内容[0005]本发明提供了一种绒毛膜间充质干细胞的