一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111197010A(43)申请公布日2020.05.26(21)申请号202010117171.8C12R1/645(2006.01)(22)申请日2020.02.25(71)申请人安徽大学地址230601安徽省合肥市经济技术开发区九龙路111号(72)发明人王永中彭慧盛康亮汪静敏孔小卫(74)专利代理机构北京力量专利代理事务所(特殊普通合伙)11504代理人姚远方(51)Int.Cl.C12N1/14(2006.01)C12N1/02(2006.01)A01N63/30(2020.01)A01P5/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用(57)摘要本发明属于生物技术领域，本发明公开了一种丝状真菌外泌体的提取方法；该方法包括如下步骤：用LNAAM培养基发酵丝状真菌，得到含有此丝状真菌外泌体的发酵液；将此发酵液去除菌丝，然后进行高速离心去除不溶性杂质，保留上清；接着使用超滤离心管进行低温超滤浓缩，使用适量PBS溶液清洗浓缩液三次；然后使用外泌体纯化柱进行纯化；最后使用0.22μm过滤器进行过滤除菌即得到真菌外泌体；该方法可快速高效地从丝状真菌发酵液中提取到高纯度、高浓度的外泌体；同时，本发明还公开了一种丝状真菌外泌体在线虫生物防治领域的应用。CN111197010ACN111197010A权利要求书1/1页1.一种丝状真菌外泌体提取方法，包括如下步骤：步骤1：用LNAAM液体培养基培养丝状真菌，其中LNAAM液体培养基含有以下成分：MgSO4·7H2O(0.2mg/ml)、KCl(1mg/ml)、FeCl3·6H2O(0.03mg/ml)、ZnSO4·7H2O(0.88μg/ml)、MnSO4·H2O(0.3μg/ml)、thiamin-HCl(2μg/ml)、biotin(0.05μg/ml)和200×氨基酸(0.5ml/100ml)，将200×氨基酸：2g赖氨酸(Lys)，2g缬氨酸(Val)，2g苯丙氨酸(Phe)，1g脯氨酸(Pro)，1g甘氨酸(Gly)，1g丙氨酸(Ala)，0.1g精氨酸(Arg)，0.1g半胱氨酸(Cys)，0.1g亮氨酸(Leu)，0.1g组氨酸(His)，0.1g甲硫氨酸(Met)，0.1g酪氨酸(Tyr)，0.1g谷氨酸(Glu)，溶于ddH2O中，定容至100ml，0.22μm水系滤器过滤除菌，存于4℃；加入孢子培养，得到含外泌体的发酵液；步骤2：将所述发酵液进行去除菌丝处理，然后进行高速离心处理，保留上清液；步骤3：将所述离心上清液用超滤离心管进行超滤浓缩，然后使用适量PBS溶液清洗浓缩液三次；步骤4：将所述浓缩液使用外泌体纯化柱进行纯化，得外泌体纯化液；步骤5：将所述纯化液使用0.22μm过滤器进行过滤除菌处理。2.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述高速离心的转速为8000-12000rpm，所述超滤离心的转速为2000-5000rpm。3.根据权利要求2所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述超滤离心管的MWCO范围为100KD-250KD。4.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述超滤离心浓缩处理的条件为：转速为3000rpm，时间为8min。5.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述外泌体制备培养基为含双抗(1％青霉素/链霉素)的LNAAM培养基。6.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述LNAAM培养基发酵丝状真菌，发酵温度为25-28℃，发酵时间为1-10天。7.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述的丝状真菌为丝状真菌的孢子或菌丝体，培养温度为25-28℃。8.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述去除菌丝处理为将发酵液使用3层至8层无菌擦镜纸、滤纸或纱布进行过滤处理。9.根据权利要求1所述的一种丝状真菌外泌体提取方法，其特征在于：所述外泌体纯化方法是使用外泌体纯化柱进行纯化，其超滤膜的MWCO为300KD-1000KD；其转速为3000rpm。10.权利要求1-9任一项所述的一种丝状真菌外泌体的应用，其特征在于：所述丝状真菌外泌体具有抑制线虫运动的活性，具有在线虫生物防治领域的应用价值。2CN111197010A说明书1/4页一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种丝状真菌外泌体提取方法及其应用。背景技术[0002]外泌体(exosomes)是一种细胞分泌的微小膜泡，具有30-200nm大小、极低密度的细胞外纳米