一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115109750A(43)申请公布日2022.09.27(21)申请号202210957255.1(22)申请日2022.08.10(71)申请人山西农业大学地址030031山西省太原市小店区龙城大街81号(72)发明人罗小毛王海东冀云燕张慧玲任华伟于秀菊(74)专利代理机构西安正华恒远知识产权代理事务所(普通合伙)61271专利代理师陈选中(51)Int.Cl.C12N5/0786(2010.01)A61K35/15(2015.01)A61P21/00(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图6页(54)发明名称一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用(57)摘要本发明公开了一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用，涉及药物提取物的制备技术领域。本发明公开的巨噬细胞外泌体是通过收集饥饿细胞培养基上清液，再经过梯度离心后获得的。本发明公开的巨噬细胞外泌体的提取方法的具体步骤为：培养巨噬细胞，然后进行饥饿处理，最后收集上清，经低速和超高速离心后，保留的沉淀即为巨噬细胞外泌体。本发明以巨噬细胞为原料，收取细胞培养上清，采用密度梯度离心方法进行提取，操作方法简便。巨噬细胞外泌体在促进肌肉损伤修复的同时为肌肉发育和肌肉相关疾病的治疗提供了新途径。CN115109750ACN115109750A权利要求书1/1页1.一种巨噬细胞外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：培养巨噬细胞并进行饥饿处理20‑30h，收集上清液并进行梯度离心，过滤后取沉淀即可；所述饥饿处理包括：将巨噬细胞培养至密度为70％‑80％，用PBS缓冲液清洗细胞1‑3次，更换无血清培养基继续培养。2.如权利要求1所述的巨噬细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述梯度离心处理具体包括以下步骤：(1)收集上清液，分别经300g的离心力和2000g的离心力离心处理8‑12min，弃去沉淀；(2)将步骤(1)制得的上清液继续以10000g的离心力离心28‑32min后弃去沉淀；(3)将步骤(2)制得的上清液继续以100000g的离心力离心55‑65min，收集沉淀；(4)将步骤(3)收集的沉淀经25‑30mL的PBS缓冲液重悬，并以100000g的离心力离心55‑65min后，取沉淀。3.如权利要求1或2所述的巨噬细胞外泌体的提取方法提取得到的巨噬细胞外泌体。4.如权利要求3所述的巨噬细胞外泌体在制备调节肌肉损伤修复药物中的应用。5.如权利要求3所述的巨噬细胞外泌体的在制备促进肌肉发育及肌肉相关疾病治疗药物方面的应用。2CN115109750A说明书1/4页一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用技术领域[0001]本发明属于药物提取物的制备技术领域，具体涉及到一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用。背景技术[0002]骨骼肌作为畜产品的重要组成部分，对畜牧业经济的发展具有深远的影响。但是现如今肌肉发育不良和肌肉萎缩相关疾病的发病率越来越高，严重阻碍了畜产品的发展。因此，改善肌肉损伤修复并促进其健康发育的技术具有巨大的经济价值。[0003]外泌体是由细胞释放的含有脂质、特定蛋白质和遗传物质的小囊泡，其特殊的膜结构，常被作为传递原细胞信息内容物、装载核酸或药物的运输工具。将外泌体应用于改善肌肉修复进程，并促进其高效应用是药物研发行业的重要方向。[0004]因此亟需一种可以高度浓缩的巨噬细胞外泌体的提取方法，以满足药物研发的需求。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用，可以对巨噬细胞外泌体进行高度浓缩式的提取，并且提取后的巨噬细胞外泌体在促进肌肉损伤修复的同时为肌肉发育和肌肉相关疾病的治疗提供了新途径。[0006]为达上述目的，本发明提供了一种巨噬细胞外泌体及其提取方法与应用，包括以下步骤：[0007]培养巨噬细胞并进行饥饿处理20‑30h，收集上清液并进行梯度离心，过滤后取沉淀即可；[0008]饥饿处理包括：将巨噬细胞培养至密度为70％‑80％，用PBS缓冲液清洗细胞1‑3次，更换无血清培养基继续培养。[0009]优选的，梯度离心处理具体包括以下步骤：[0010](1)收集上清液，分别经300g的离心力和2000g的离心力离心处理8‑12min，弃去沉淀；[0011](2)将步骤(1)制得的上清液继续以10000g的离心力离心28‑32min后弃去沉淀；[0012](3)将步骤(2)制得的上清液继续以100000g的离心力离心55‑65min，收集沉淀；[0013](4)将步骤(3)收集的沉淀经25‑30mL的PBS缓冲液重悬，并以100000g的离心力离心55‑65min后，取沉淀。[0014]本发明通过上述巨噬细胞外泌体的提取方法提取得到了巨噬细胞外泌体。[0015]本发明提取的上述巨