尿源干细胞外泌体的提取方法及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108715830A(43)申请公布日2018.10.30(21)申请号201810420845.4(22)申请日2018.05.04(71)申请人中南大学湘雅医院地址410008湖南省长沙市湘雅路87号(72)发明人谢辉陈春媛饶珊珊刘祎伟谭艺娟胡雄科罗明洁胡阴殷豪黄杰罗娟(74)专利代理机构北京纽乐康知识产权代理事务所(普通合伙)11210代理人罗莎(51)Int.Cl.C12N5/074(2010.01)A61K35/28(2015.01)A61P19/10(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图7页(54)发明名称尿源干细胞外泌体的提取方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种尿源干细胞外泌体的提取方法及其应用，所述提取方法的具体过程如下：1）收集尿液后第一次离心，去除上清液后所得第一残留液体中加入PBS，进行第二次离心，去除上清液后所得第二残留液体用原代培养基重悬得到尿源干细胞悬浮液；2）将尿源干细胞悬浮液扩增培养，传代至第2~6代后，待用；3）将步骤2）所得细胞的培养基进行更换后继续培养，收集培养上清液，离心、过滤、离心浓缩后加入外泌体提取试剂进行提取，得到尿源干细胞外泌体的重悬液。本发明提取的尿源干细胞外泌体通过动物实验证明尿源干细胞外泌体对于老年骨质疏松症、绝经后骨质疏松症和废用性骨质疏松症均有治疗效果。CN108715830ACN108715830A权利要求书1/2页1.一种尿源干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，具体过程如下：1）收集尿液后第一次离心，去除上清液后所得第一残留液体中加入PBS，进行第二次离心，去除上清液后所得第二残留液体用原代培养基重悬得到尿源干细胞悬浮液；2）将尿源干细胞悬浮液扩增培养，传代至第2~6代后，待用；3）将步骤2）所得细胞的培养基进行更换后继续培养，收集培养上清液，离心、过滤、离心浓缩后加入外泌体提取试剂进行提取，得到尿源干细胞外泌体的重悬液。2.根据权利要求1所述的尿源干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述尿液来自健康成年人的清洁中段尿；所述第一次离心的条件为：400×g离心10分钟；所述第一残留液体与PBS的用量体积比为1:10；所述第二残留液体与原代培养基的用量体积比为1:15；所述原代培养基为含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素和REGMSingleQuot生长因子添加剂的DMEM/F-12培养基。3.根据权利要求1所述的尿源干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，步骤2）中，所述扩增培养的过程如下：将尿源干细胞悬浮液在37°C，5%CO2条件下培养，96h内每隔48h补充1mL扩增培养基，96h后每隔48h更换1mL扩增培养基，待细胞密度达到80~90%时传代。4.根据权利要求3所述的尿源干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，所述扩增培养基为含有10%胎牛血清、1%GlutaMAX、1%非必需氨基酸、5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL血小板衍生生长因子-BB、5ng/mL表皮生长因子、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基与含REGMSingleQuot生长因子添加剂的RBM培养基的体积比为1:1的混合液。5.根据权利要求1所述的尿源干细胞外泌体的提取方法，其特征在于，步骤3）中，所述培养基更换为不含外泌体的新鲜扩增培养基；所述不含外泌体的新鲜扩增培养基为含有10%去外泌体的胎牛血清、1%GlutaMAX、1%非必需氨基酸、5ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、5ng/mL血小板衍生生长因子-BB、5ng/mL表皮生长因子、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基与含REGMSingleQuot生长因子添加剂的RBM培养基的体积比为1:1混合液；所述离心、过滤、离心浓缩的具体过程如下：将收集的培养上清液，离心去除残存细胞和细胞碎片，0.22μm无菌过滤器过滤，将过滤后液体转移至15mL的10KD超滤离心管，4000×g，4℃离心约20分钟，使超滤液浓缩至1mL；向超滤液中加入14mLPBS，4000×g，4℃离心约15分钟，使超滤液浓缩至1mL，得到浓缩液；所述浓缩液与外泌体提取试剂按照体积比1:5的比例进行提取，提取的过程如下：将浓缩液与外泌体提取试剂混合后，4℃孵育12h，接着离心，1500×g，4℃离心30分钟，弃上清，用无菌PBS重悬沉淀，即得到尿源干细胞外泌体的重悬液；所述外泌体提取试剂为Exoquick-TCTM外泌体提取试剂。6.一种权利要求1~5任一所述的方法提取的尿源干细胞外泌体在制备防治骨质疏松症药物、食品或保健品中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述尿源干细胞