一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111471720A(43)申请公布日2020.07.31(21)申请号202010456216.4C12N1/19(2006.01)(22)申请日2020.05.26C12R1/865(2006.01)(71)申请人苏州泓迅生物科技股份有限公司地址215123江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园C20栋(72)发明人朱佑民陶小倩程倩王梓旭邢妍婧赵一凡柳伟强杨平(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332代理人巩克栋(51)Int.Cl.C12N15/90(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12N9/22(2006.01)C12N15/66(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表2页附图4页(54)发明名称一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用(57)摘要本发明提供一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。所述自杀他杀式质粒包括复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。将基因编辑载体转入酿酒酵母中，再转入所述自杀他杀式质粒，即可得到无痕编辑后的酿酒酵母菌株。利用所述自杀他杀式质粒编辑酿酒酵母，既不影响基因编辑后对成功转化基因编辑质粒的菌株进行选择，又显著提高了消除质粒成功率；同时，经过两轮质粒转化即可达到无痕编辑的效果，进一步加快了酿酒酵母无痕编辑的速率。CN111471720ACN111471720A权利要求书1/2页1.一种自杀他杀式质粒，其特征在于，所述自杀他杀式质粒包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。2.根据权利要求1所述的自杀他杀式质粒，其特征在于，所述针对基因编辑载体和自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1为针对Cas9序列设计的sgRNA；优选地，所述sgRNA1表达框中的启动子包括SNR52；优选地，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列；优选地，所述Cas9蛋白表达框中的启动子包括TEF1；优选地，所述Cas9蛋白的核定位信号包括SV40NLS；优选地，所述Cas9蛋白的终止序列包括CYC1。3.根据权利要求1或2所述的自杀他杀式质粒，其特征在于，所述基因编辑载体包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA2表达框；优选地，所述自杀他杀式质粒的复制起点与基因编辑载体的复制起点相同，所述复制起点包括原核生物中的复制起点和真核生物中的复制起点；优选地，所述自杀他杀式质粒的筛选标记与基因编辑载体的筛选标记相同，所述筛选标记包括原核生物中的筛选标记和真核生物中的筛选标记；优选地，所述原核生物包括大肠杆菌；优选地，所述真核生物包括酵母菌。4.如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：将sgRNA1序列设计为带有同源臂的正向引物和反向引物，再将所述正向引物和反向引物合成为sgRNA1的双链序列；将载体酶切后的得到的线性化载体与sgRNA1的双链序列混合，反应得到所述自杀他杀式质粒。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述线性化载体和sgRNA1的浓度总和为100～800ng/μL，优选为200～300ng/μL；优选地，所述线性化载体和sgRNA1的摩尔比为1:1；优选地，所述反应条件包括在49～51℃下反应0.5～2h，优选为在50℃下反应1.5h。6.一种酿酒酵母无痕基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)构建基因编辑载体并将其转入酿酒酵母的感受态细胞中，筛选出成功转入所述基因编辑载体的酿酒酵母；(2)将如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒转入步骤(1)所得到的酿酒酵母的感受态细胞，培养、筛选得到无痕编辑后的酿酒酵母菌株。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)所述转入的方法均包括电转化法；优选地，步骤(2)所述培养的方法为：在液体培养基中悬浮培养1～2h后接种于相应平板上，25～30℃下培养3～5天；优选地，步骤(2)所述筛选的方法为：选择在含有选择标记的平板上不生长、在无选择标记的平板上生长的酿酒酵母菌株，即为无痕编辑后的酿酒酵母菌株；2CN111471720A权利要求书2/2页优选地，所述选择标记包括G418。8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)将sgRNA2序列