一种基因编辑效率提高的引导碱基编辑系统及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114763556A(43)申请公布日2022.07.19(21)申请号202011621689.1C12N5/10(2006.01)(22)申请日2020.12.31A01H5/00(2018.01)A01H6/46(2018.01)(71)申请人北京市农林科学院地址100097北京市海淀区曙光花园中路9号北京市农林科学院玉米研究中心(72)发明人徐雯杨进孝杨永星康桂婷李璐(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司11245专利代理师关畅(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/113(2010.01)C12N9/22(2006.01)C12N9/12(2006.01)权利要求书3页说明书17页序列表24页附图1页(54)发明名称一种基因编辑效率提高的引导碱基编辑系统及其应用(57)摘要本发明公开了一种基因编辑效率提高的引导碱基编辑系统及其应用。所述引导碱基编辑系统包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；所述融合蛋白包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述pegRNA包括esgRNA、逆转录模板序列和引物结合位点序列；所述逆转录模板序列中引入的突变碱基包括在目标突变位点引入的突变碱基和在目标突变位点以外的其它位点引入的额外的突变碱基。通过实验证明：该引导碱基编辑系统可显著提高PE‑P2或PE‑P3引导编辑系统的编辑效率。CN114763556ACN114763556A权利要求书1/3页1.成套系统，为成套系统甲或成套系统乙；所述成套系统甲包括反转录酶或与其相关的生物材料、Cas9切刻酶或与其相关的生物材料、筛选标记蛋白或与其相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；所述成套系统乙包括融合蛋白或与所述融合蛋白相关的生物材料、pegRNA或与所述pegRNA相关的生物材料；所述融合蛋白包括反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白；所述pegRNA包括esgRNA、逆转录模板序列和引物结合位点序列；所述逆转录模板序列中引入的突变碱基包括在目标突变位点引入的突变碱基和在目标突变位点以外的其它位点引入的额外的突变碱基。2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述成套系统乙中，所述融合蛋白为如下任一种：依次由Cas9切刻酶、反转录酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白，依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、Cas9切刻酶和反转录酶组成的融合蛋白，依次由反转录酶、Cas9切刻酶、自切割寡肽和筛选标记蛋白组成的融合蛋白，依次由筛选标记蛋白、自切割寡肽、反转录酶和Cas9切刻酶组成的融合蛋白。3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9切刻酶为Cas9n(H840A)；和/或，所述Cas9n(H840A)为A1)或A2)：A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述Cas9n(H840A)的编码基因为a1)或a2)或a3)：a1)序列1第2293‑6393位所示的cDNA分子或DNA分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子；a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Cas9n(H840A)的cDNA分子或DNA分子。4.根据权利要求1‑3任一所述的成套系统，其特征在于：所述反转录酶为M‑MLVRT；和/或，所述M‑MLVRT为B1)或B2)：B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述M‑MLVRT的编码基因为b1)或b2)或b3)：b1)序列1第6493‑8523位所示的cDNA分子或DNA分子；b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述M‑MLVRT的cDNA分子或DNA分子；b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述M‑MLVRT的cDNA分子或DNA分子。5.根据权利要求1‑4任一所述的成套系统，其特征在于：所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；和/或，所述潮霉素磷酸转移酶为D1)或D2)：2CN114763556A权利要求书2/3页D1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；D2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；和/或，所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为d1)或d2)或d3)：d