PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113817847A(43)申请公布日2021.12.21(21)申请号202111257347.0(22)申请日2021.10.27(71)申请人深圳因诺免疫有限公司地址518000广东省深圳市大鹏新区葵涌街道国际生物谷生命科学产业园(奔康工业区)C2栋申请人深圳市因诺转化医学研究院(72)发明人王俊涛程玉张锦玲王明军(74)专利代理机构深圳市精英专利事务所44242代理人李莹(51)Int.Cl.C12Q1/6888(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书10页序列表1页附图1页(54)发明名称PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法(57)摘要本发明公开了一种PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法，涉及生物制品质量控制检测技术领域。本发明提供的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法，采用探针qPCR法，具有引物和探针双重特异性，提高了检测的特异性和准确性，灵敏度高，检测定量限可低至3pg/mL，适用于由PG13细胞表达或生产的细胞产品、半成品的快速放行质控。本发明基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR技术，具有高效、快速、准确、特异性强的优点。CN113817847ACN113817847A权利要求书1/1页1.PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，其特征在于，包括引物对及探针；所述引物对、探针的核苷酸序列如下所示，或与这些序列具有至少95％同一性的同功能序列；Primer‑F：TCCGAAGGTCCAGAGTTCAA；Primer‑R：TCAGACACTCCAGAAGAGGG；Probe：CCACATGGTGGCTCACAACCATCCGTA；所述探针上连接有荧光基团。2.如权利要求1所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，其特征在于，所述探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为TAMRA。3.如权利要求1所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，其特征在于，还包括PremixExTaq、ROXReferenceDyeII、UltraPurewater、PG13细胞标准品。4.如权利要求3所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，其特征在于，荧光定量qPCR检测的反应体系中，引物的反应浓度为10μM，探针的反应浓度为10μM。5.如权利要求4所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，其特征在于，荧光定量qPCR检测的反应体系为15μL，其组成为PremixExTaq10μL、Primer‑F0.4μL、Primer‑R0.4μL、Probe0.8μL、ROXReferenceDyeII0.2μL、UltraPurewater3.2μL。6.如权利要求5所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒，其特征在于，荧光定量qPCR检测的反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃5s，63℃34s，40个循环。7.如权利要求1‑6任一项所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒在检测由PG13细胞表达或生产的产品中DNA残留量的应用，所述产品包括细胞产品、重组疫苗或单克隆抗体。8.一种PG13宿主细胞DNA残留检测方法，其特征在于，包括步骤：使用磁珠法进行样品前处理；配制标准曲线用标准品溶液；使用如权利要求1‑6任一项所述的PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒对样品进行DNA残留量的检测。9.如权利要求8所述的PG13宿主细胞DNA残留检测方法，其特征在于，还包括制备PG13细胞标准品，并精确测定PG13细胞标准品中PG13细胞基因组DNA的浓度。2CN113817847A说明书1/10页PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及生物制品质量控制检测技术领域，尤其涉及PG13宿主细胞DNA残留检测试剂盒及检测方法。背景技术[0002]PG13细胞作为包装细胞应用于细胞产品(如CAR‑T或TCR‑T细胞等)的开发，通常是采用PG13细胞包装逆转录病毒，生产逆转录病毒载体，再侵染患者T淋巴细胞，制成细胞制剂。PG13细胞作为生产逆转录病毒载体的包装细胞，其残留DNA可能存在潜在致癌性，因此，从安全性角度，需要对产品的PG13细胞DNA残留制定限度标准，《中国生物制品规程》中规定rDNA含量每剂量应不高于10ng。《中国药典》2020版(三部)中提出需采用适宜的方法对生物制品中的宿主DNA进行检测，限定标准在各论中多为小于10ng/剂。美国食品药品监督管理局(FDA)颁布的指导原则规定生物制品宿主细胞DNA残留量不得超过100pg/剂，对于大剂量的生物制品，根据其残余DNA来源和给药途径，宿主DNA的残留量不超过10ng/剂。