分离胎盘间充质干细胞的方法和使用的无血清培养基.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112458047A(43)申请公布日2021.03.09(21)申请号202011381195.0(22)申请日2020.11.30(71)申请人博雅干细胞科技有限公司地址214092江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号博雅干细胞公司(72)发明人王正刘冰肖海蓉(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书2页说明书13页附图1页(54)发明名称分离胎盘间充质干细胞的方法和使用的无血清培养基(57)摘要本发明涉及分离胎盘间充质干细胞的方法和使用的无血清培养基。具体的，本发明分离培养原代胎盘间充质干细胞的方法包括如下步骤：处理胎盘样本；使用D‑Hanks液清洗，剪下胎盘绒毛膜，剪碎，清洗，过滤去除组织中残留的血液细胞，加Ⅱ型胶原酶振荡消化，加D‑hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养，4d半换液、7d全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D‑hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D‑hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞。本发明方法呈现如说明书所述优异技术效果。CN112458047ACN112458047A权利要求书1/2页1.分离培养原代胎盘间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的胎盘样本；(2)使用D-Hanks液清洗一遍，剪下胎盘绒毛膜，剪碎，D-Hanks清洗一遍，用300目滤网过滤去除组织中残留的血液细胞，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；(5)培养至第4d时半换液，至第7d时全换液，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代胎盘间充质干细胞。2.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；和/或，将胎盘样本剪碎至0.25±0.05cm2大小。3.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。4.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×105/cm2接种至T225瓶，例如是指按照细胞量2×105/cm2接种至T225瓶。5.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度。6.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min。7.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，每瓶加入25ml的D-hanks液稀释。8.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中，以100xg离心10min。9.根据权利要求1的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得；或者，所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF；或者，所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替；或者，所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、10ng/ml的EGF、20ng/ml的bFGF、0.12％硫代甘油、1％果糖；或者，所述DMEM-F12培养基配方组成如下：无水氯化钙116.6mg、L-亮氨酸59.05mg、亚油酸0.042mg、五水硫酸铜0.0013mg、L-赖氨酸盐酸盐91.25mg、硫辛酸0.105mg、九水硝酸铁0.05mg、L-蛋氨酸17.24mg、酚红8.1mg、七水硫酸亚铁0.417mg、L-苯丙氨酸35.48mg、1,4-丁二胺二盐酸盐0.081mg、氯化钾311.8mg、L-丝氨酸26.25mg、丙酮酸钠55mg、氯化镁28.64mg、L-苏氨酸53.45mg、维生素H0.0035mg、无水硫酸镁48.84mg、L-丙氨酸4.45mg、D-泛酸钙2.24mg、氯化钠70