无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112522193A(43)申请公布日2021.03.19(21)申请号202011568942.1(22)申请日2020.12.25(71)申请人博雅干细胞科技有限公司地址214092江苏省无锡市滨湖区马山梅梁路88号博雅干细胞公司(72)发明人王正刘冰肖海蓉汤乐(51)Int.Cl.C12N5/0775(2010.01)权利要求书3页说明书22页附图1页(54)发明名称无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途(57)摘要本发明涉及无血清培养基在分离和传代脂肪间充质干细胞中的用途。具体涉及分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，(b)阶段是将原代间充质干细胞接种，补充传代完全培养基培养，用D‑hanks液清洗，加重组胰酶溶液消化，得到P1代间充质干细胞；接着将P1代间充质干细胞接种参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞，继续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。本发明使用无血清培养基分离培养和传代培养脂肪间充质干细胞的方法呈现优异的技术效果，例如细胞收率高、细胞活率高。CN112522193ACN112522193A权利要求书1/3页1.分离和传代培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞和(b)传代培养脂肪间充质干细胞两个阶段，其中(a)分离培养原代脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：(a1)在生物安全柜中处理经2‑8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；(a2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D‑Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；(a3)消化结束后，加一倍体积D‑hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；(a4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；(a5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D‑hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D‑hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞(即P0代)；(b)传代培养脂肪间充质干细胞的阶段包括如下步骤：(b1)按照5000/cm2密度接种原代(即P0代)间充质干细胞于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中培养至细胞融合度达70～80％时(一般第3天可达)，弃旧培养基，用D‑hanks液清洗细胞后，每瓶加5ml重组胰酶溶液消化细胞2min使细胞脱落，每瓶加D‑hanks液15ml稀释，合并所有细胞悬液至50ml离心管内，离心，用传代完全培养基使细胞沉淀重悬，得到P1代间充质干细胞[接着可以取样进行细胞计数及活率测定]；(b2)按照5000/cm2密度将P1代间充质干细胞接种于T225瓶中，补充传代完全培养基至45ml，置CO2培养箱(5％CO2，37℃，饱和湿度)中，参照P1传代培养方法，得到P2代间充质干细胞；接着照以上P1代和P2代的方法将细胞持续传代至P10代，得到各代次的间充质干细胞。2.根据权利要求1的方法，其中：步骤(a2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；步骤(a2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min；步骤(a3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作；步骤(a4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5×104/cm2接种至T75瓶，例如是指按照细胞量2×104/cm2接种至T75瓶；和/或，步骤(a4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度。3.根据权利要求1的方法，其中：步骤(a5)中，每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；步骤(a5)中，每瓶加入10ml的D‑hanks液稀释；和/或步骤(a5)中，以100xg离心10min。4.根据权利要求1的方法，其中：所述D‑Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得；所述原代完全培养基是以DMEM‑F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF；和/或2CN112522193A权利要求书2/3页所述原代完全培养基改用原代增补培养基代替。5.根据权利要求1的方法，所述