人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN108998409A(43)申请公布日2018.12.14(21)申请号201810904418.3(22)申请日2018.08.09(71)申请人广州杜德生物科技有限公司地址510310广东省广州市海珠区石榴岗路10号生物工程大厦10-12层(72)发明人夏凡张洁(74)专利代理机构北京栈桥知识产权代理事务所(普通合伙)11670代理人胡颖(51)Int.Cl.C12N5/073(2010.01)C12N5/0735(2010.01)权利要求书2页说明书5页(54)发明名称人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法(57)摘要本发明公开了一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，包括：(1)胎盘处理；(2)细胞悬液预分离；(3)流式吸附分离；(4)胎盘间充质干细胞的脱附与分离；(5)人胚胎滋养细胞的纯化。本发明将抗体蛋白种植在温敏性壳聚糖共聚膜的外表面上，通过抗体对胎盘间充质干细胞的表面分子进行识别，来达到特异性结合的目的，并以流速递减的循环方式将胎盘间充质干细胞存留在特异温敏性壳聚糖共聚膜上。再利用降温加洗脱液的方式进行胎盘间充质干细胞与蛋白抗体的脱附与分离。本发明的分离方式温和，细胞存活率高，纯度也高。CN108998409ACN108998409A权利要求书1/2页1.一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)胎盘处理：将胎盘进行清洗和除菌处理后，得到胎盘组织，再将所述胎盘组织利用消化液进行组织消化，得到一次细胞悬液；(2)细胞悬液预分离：取一定量的所述一次细胞悬液移至离心管内，并向离心管中缓慢加入细胞分离液，细胞分离液与一次细胞悬液的体积比为1:7-10，在37℃，1300g离心力，水平转子离心30min，取细胞层，并用PBS重悬细胞，得到二次细胞悬液；(3)流式吸附分离：将所述二次细胞悬液利用稀释液稀释后，再利用机器吸取稀释后的二次细胞悬液，在37-40℃温度下，以一定的初始流速通过填充有特异温敏性壳聚糖共聚膜的玻璃管，流出所述玻璃管的二次细胞悬液再次经机器吸取后，以变差速在玻璃管内循环流通25min，再以稀释液润洗玻璃管，并收集回流液，胎盘间充质干细胞特异性吸附在特异温敏性壳聚糖共聚膜上，人胚胎滋养细胞停留在所述回流液内；(4)胎盘间充质干细胞的脱附与分离：向吸附有胎盘间充质干细胞的特异温敏性壳聚糖共聚膜玻璃管中注入洗脱液，并降温至18-20℃，封闭停留3-5min，再用洗脱液反复冲洗5-8次，收集冲洗液，将所述冲洗液在1000g离心力，水平转子离心15min，弃上清液，再向胎盘间充质干细胞中加入PBS液进行重悬，得到原代胎盘间充质干细胞并计数；(5)人胚胎滋养细胞的纯化：将含有人胚胎滋养细胞的回流液在1000g离心力，水平转子离心15min，弃上清液，再向人胚胎滋养细胞中加入PBS液进行重悬，用差速贴壁法去除成纤维细胞后计数。2.根据权利要求1所述的一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤(2)中所述细胞分离液按照重量百分比计包括：7.8-12.6％纳米结晶纤维素、5.3-10.4％聚蔗糖、5.3-10.4％泛影葡胺、1.5-3.5％氯化钠，余量为PBS缓冲液。3.根据权利要求2所述的一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，所述细胞分离液的密度为1.077-1.079g/mL。4.根据权利要求1所述的一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中特异温敏性壳聚糖共聚膜的制备方法包括以下步骤：(A)选取由丙烯酸、壳聚糖、N-异丙基丙烯酰胺原料制成的温敏性壳聚糖共聚膜，并进行裁剪；(B)将裁剪后的温敏性壳聚糖共聚膜浸泡在0.1mM的CTAB溶液中处理30min，使温敏性壳聚糖共聚膜表面形成分散状的球状凹坑，再利用无菌水冲洗至无泡，真空干燥，待用；(C)把抗体蛋白按照5×106个/mL的密度接种在干燥后的温敏性壳聚糖共聚膜的外表面，加入封闭液，密封保存，即得特异温敏性壳聚糖共聚膜。5.根据权利要求1所述的一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中流式吸附分离的流速参数为：第0min，10m/s；第1-3min，8m/s；第4-8min，6m/s；第9-14min，4m/s；第15-20min，2m/s；第21-25min，1m/s。6.根据权利要求1所述的一种人胚胎滋养细胞和胎盘间充质干细胞的分离纯化方法，其特征在于，步骤(3)中流式吸附分离的流速参数为：第0min，10m/s；第1-3min，8m/s；第4-8min，6m/s；第9-14min，4m/s；第15-20m