一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112798792A(43)申请公布日2021.05.14(21)申请号202011590022.X(22)申请日2020.12.29(71)申请人东曜药业有限公司地址215024江苏省苏州市苏州工业园区长阳街120号(72)发明人王海燕刘西燕连晓宁胡绪亮徐瑞君张亚楠刘军黄纯莹(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人王欢(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/58(2006.01)G01N33/543(2006.01)权利要求书1页说明书12页附图4页(54)发明名称一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法(57)摘要本发明涉及生物医学分析技术领域，尤其涉及一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒。本发明试剂盒利用CHO宿主细胞蛋白作为标准品和抗原制备抗体，具有特异性高、灵敏度高、检测效率高的特点，可同时检测多个样品，定量限达到5ppm，使用设备简单，操作方便，检测成本低。CN112798792ACN112798792A权利要求书1/1页1.一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒，其特征在于，包括：包被有CHODG44捕获抗体的酶标板、生物素标记的CHODG44报告抗体和酶标记的链霉亲和素；所述CHODG44捕获抗体和CHODG44报告抗体识别均由CHO宿主细胞蛋白作为免疫原免疫兔子制得，两种抗体识别CHO宿主细胞蛋白不同的抗原表位。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述免疫的兔子的数量为12只，每只兔子注射3～10次免疫原，每次注射0.1‑10mg。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述注射为：第一次注射时免疫原混合Freund完全佐剂，在之后的注射中，免疫原混合Freund不完全佐剂。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述CHODG44捕获抗体和CHODG44报告抗体为多克隆抗体。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的链霉亲和素为辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括显色液和终止液。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述显色液为TMB。8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述终止液为硫酸溶液。9.根据权利要求1～8任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准品，所述标准品为CHODG44宿主细胞蛋白。10.一种检测生物医药制品中CHO细胞宿主蛋白残留的方法，其特征在于，利用权利要求1～9任一项所述的试剂盒检测CHO细胞宿主蛋白残留，包括以下步骤：步骤1：用CHODG44捕获抗体包被酶标板；步骤2：向步骤1制得的酶标板中加入待测样本和标准品溶液，孵育，洗涤；步骤3：向步骤2洗涤后的酶标板中加入生物素标记的CHODG44报告抗体，孵育，洗涤；步骤4：向步骤3洗涤后的酶标板中加入酶标记的链霉亲和素，孵育，洗涤；步骤5：向步骤4洗涤后的酶标板中加入显色液显色，孵育，加入终止液终止反应，于450nm波长下测定吸收度值。2CN112798792A说明书1/12页一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法技术领域[0001]本发明涉及生物医学分析技术领域，尤其涉及一种检测CHO细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法。背景技术[0002]CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，该细胞表达的蛋白最接近于天然蛋白分子、产物胞外分泌但很少分泌自身内源蛋白，对目标蛋白分离纯化工作十分有利，是目前在单抗和重组蛋白类生物制品中被广泛使用的工程细胞，CHO细胞表达系统具有表达遗传背景清楚、表达系统完善稳定、蛋白表达水平较高等优势。[0003]CHO分泌的内源蛋白很少但是仍然会有少量蛋白残留在生物制品的半成品和成品中。CHO细胞中残留的宿主蛋白(HCP)作为人类自身系统的外源蛋白，残留在成品中的CHOHCP可能会引起免疫应答，甚至给病人带来病理反应。同时残留HCP也有可能会降低蛋白药物效果。因此生物医药企业在质控环节必须对生产的半成品或成品的HCP进行定量测定。[0004]目前，用于HCP测定的方法主要是ELISA法，ELISA方法作为一种经典的方法，因其高灵敏度和特异性被广泛应用。药典2020版规定药物中宿主细胞蛋白质残留量用酶联免疫吸附法测定，应不高于蛋白质总量的0.01％。商品化ELISA试剂盒在制备时消除不同CHO细胞系引起的HCP的差异，从而适用于一系列重组CHO细胞系。但是商业化试剂盒价格昂贵，标准品储量有限，会在一定时间内更换标准品与特异性抗血清批号，这些原因也极大地限制了该方法的应用。有研究表明：(1)不同检测试剂盒之间结果存在较大偏差；(2)同一检测试剂和替换标准品后测得结果有较大差异；(3)标准品的