一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114544841A(43)申请公布日2022.05.27(21)申请号202011325866.1(22)申请日2020.11.24(71)申请人湘潭智联技术转移促进有限责任公司地址411101湖南省湘潭市高新区湘潭大道281号万达广场B座1802016号(72)发明人向海(74)专利代理机构湖南乔熹知识产权代理事务所(普通合伙)43262专利代理师安曼(51)Int.Cl.G01N30/88(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖-蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法(57)摘要本发明公开了一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其中，所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。本发明采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法采用反相离子对色谱法，通过优化的色谱条件，实现了DMAP在色谱柱上的保留，并且排除了溶剂和杂质的干扰，准确度高，重复性好，将该方法用于肺炎球菌‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的测定，结果良好。CN114544841ACN114544841A权利要求书1/1页1.一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱法检测肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中的DMAP残留量，其中流动相为5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液，色谱柱为C18色谱柱。2.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，5mmol/L庚烷磺酸钠溶液与乙腈混合液的体积比为13:87。3.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述5mmol/L庚烷磺酸钠溶液含20mmol/L磷酸二氢钾，磷酸调pH至3.0。4.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述检测方法以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线Y＝1E+07X+340514，相关系数R2＝0.9999。5.根据权利要求4所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，绘制所述标准曲线的标准品浓度为1mg/ml。6.根据权利要求5所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述标准品的制备为：准确称取DMAP标准品50mg，用甲醇/水＝90/10(V/V)溶解并定容至50ml。7.根据权利要求5所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述标准品溶液分别用流动相稀释至浓度为0.05μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、10μg/ml以绘制标准曲线。8.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，所述色谱柱为SepaxHP‑C18色谱柱。9.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，DMAP作为CDAP的活化产物，CDAP活化多糖中间产物的制备步骤如下：a)加入蛋白前中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤；b)加入蛋白后中间产物制备：取肺炎球菌多糖溶液搅拌均匀，加入CDAP乙腈溶液，用NaOH调节pH至9.5，持续搅拌2min，加入CRM197蛋白溶液，用NaOH调节pH至9.5，搅拌均匀，取样用0.45μm水系滤器过滤。10.根据权利要求1所述的采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法，其特征在于，供试品溶液的制备方法为：取1ml肺炎球菌多糖‑蛋白结合液，加100μl10％脱氧胆酸钠溶液(现配现用)，涡旋混匀，于冰水浴中放置30min。取出后立即加入50μl盐酸溶液(86→1000)，涡旋混匀，10000rpm离心15min，取上清液用0.45μm水系滤器过滤。2CN114544841A说明书1/6页一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP残留量的方法技术领域[0001]本发明涉及一种采用高效液相色谱法测定肺炎球菌多糖‑蛋白结合疫苗中DMAP