多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111855827A(43)申请公布日2020.10.30(21)申请号201910332690.3(22)申请日2019.04.24(71)申请人岛津企业管理（中国）有限公司地址100000北京市朝阳区朝外大街16号中国人寿大厦602申请人中国食品药品检定研究院(72)发明人龙珍李茂光李月琪李亚南李长坤毛琦琦黄涛宏许美凤(74)专利代理机构济南克雷姆专利代理事务所(普通合伙)37279代理人张祥明(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)权利要求书5页说明书14页附图4页(54)发明名称多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法(57)摘要本发明公开了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法：(1)标准品的酶解；(2)固相萃取富集目标肽段；(3)高效液相色谱串联质谱分析；(4)绘制标准曲线，得标准工作曲线方程；(5)样品检测，计算得到样品中各特征肽段的浓度；(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率。本发明实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测，其中破伤风蛋白涉及20个监测位点，CRM197涉及16个监测位点。本发明不仅可以检测残留蛋白含量，还可以评价多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合位点的结合率，也可用于多糖或蛋白残余率相同但活性和毒性不同的多糖蛋白结合疫苗的研究，可为改进多糖蛋白结合工艺提供直接的监测方法。CN111855827ACN111855827A权利要求书1/5页1.一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或CRM197蛋白为载体的疫苗，其特征在于：包括以下步骤：(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；(4)绘制标准曲线：各特征肽段峰的峰面积与特征肽段的浓度呈线性关系，各特征肽段的浓度与蛋白溶液的浓度相同；配制不同浓度的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，通过步骤(1)、(2)、(3)得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A＝aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；(5)样品检测：取待检测的多糖蛋白结合疫苗样品溶液，进行步骤(1)、(2)、(3)，得各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：多糖结合位点N的多糖结合率W％＝(样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度)/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；多糖结合位点N的蛋白残留率C％＝特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；N代表某一特征肽段；数值最小的C％作为该样品中残留蛋白率。2.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体操作如下：①取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；④加入胰蛋白酶，或：加入胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液，37℃反应4～20小时；⑤加入酸液，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。3.根据权利要求1或2所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGestTM；或/和：所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；或/和：所述碳酸氢铵溶液的浓度为10～500mmol/L；或/和：所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10mmol/L～2mol/L；或/和：所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸。4.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其2CN111855827A权利要求书2/5页特征在于：所述步骤(2)中，固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相(WAX)、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相(SAX)、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离