高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111855847A(43)申请公布日2020.10.30(21)申请号202010653368.3G01N21/64(2006.01)(22)申请日2020.07.08(71)申请人浙江大学地址310058浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人王凤芹汪以真曹进平路则庆程远之(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司33200代理人林松海(51)Int.Cl.G01N30/02(2006.01)G01N30/06(2006.01)G01N30/36(2006.01)G01N30/74(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图2页(54)发明名称高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法(57)摘要本发明公开了一种高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法。该方法以2,3—二氨基萘为螯合剂，以400µL乙腈为分散剂，120µL氯苯为萃取剂，硒（IV）与2,3—二氨基萘的螯合物（4,5‑苯并苤硒脑）经乙腈稀释后直接采用PFP色谱柱分离，乙腈洗脱，用荧光检测器在激发波长为376nm、发射波长为520nm条件下测定荧光强度，外标法定量。本方法具有实验结果稳定、样品转移少、试剂用量少、回收率高等特点。CN111855847ACN111855847A权利要求书1/1页1.一种高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法，其特征是：富硒蛋白多糖采用HNO3—HClO4体系消解后，以2,3—二氨基萘为螯合剂，乙腈为分散剂，氯苯为萃取剂，硒（IV）与2,3—二氨基萘的螯合物Se-DAN经乙腈1:1稀释后采用PFP色谱柱分离，乙腈洗脱，用荧光检测器在激发波长为376nm、发射波长为520nm条件下测定荧光强度，外标法定量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：称取25mg富硒蛋白多糖样品，加10mLHNO3-HClO4混合酸，其中内含9mlHNO3和1mlHClO4，冷消化过夜；12h后于电热板上加热消解至剩余体积2mL，冷却后再加入5mL6mol/L盐酸溶液，继续加热至剩余体积2mL，冷却后调节pH值1.5~2.0之间，并用水定容至250mL，取出3mL样品至5mL具塞离心管中，向其中加入0.5mLDAN，沸水浴反应10分钟，流水冷却后，再向其中先后加入400μL乙腈和120μL氯苯，振摇5分钟，然后静置5分钟，最后以5000rpm/min的转速，离心5分钟；移取100μL氯苯并向其中加入100μL乙腈，混匀后进样，经PFP色谱柱分离，串联紫外与荧光检测器（RPHPLC-UV-FLD）检测分析。2CN111855847A说明书1/4页高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法技术领域[0001]本发明涉及一种高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法。背景技术[0002]硒（Se）作为动物生命必需微量元素和较窄的安全阈值以及其不同生物活性依赖于不同的存在形态等原因，对硒在不同基质中的分析方法研究一直引起广泛的关注。此外，亚硒酸盐和有机硒化合物作为一种饲料添加剂加入饲料中。因此，建立可靠的硒测定方法是非常有必要的。目前测定硒含量有各种高选择性的分析技术，包括原子吸收光谱法（AAS）、原子发射光谱法（AES）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）]和大气压化学电离质谱法（APCI-MS）等，这些技术常用于测定土壤、食品、水和生物样品中的硒含量。然而，这些技术需要昂贵的设备，普通实验室很难配置。最常规的硒测定方法是荧光测定技术，使用2,3—二氨基萘（DAN）作为衍生化试剂与硒（IV）生成硒螯合物（4,5-苯并苤硒脑，Se-DAN），再利用荧光分光光度计检测。高效液相色谱法用于许多领域的常规分析，其成本为相对较低，衍生法用以提高仪器检测灵敏度。除此之外，因样品中基质干扰，使得硒含量难以得到准确测定。因此，往往需要对样品有一个提取和浓缩的前处理步骤。迄今为止，对于硒螯合物的前处理方法主要有液液萃取法和分散液液微萃取法，液液萃取法主要是以环己烷作为萃取剂，在硒（IV）与2,3—二氨基萘生成螯合物后，对4,5-苯并苤硒脑进行萃取，而分散液液微萃取法是以乙腈为分散剂，氯苯为萃取剂，让体系形成萃取液滴，实现提取和预浓缩一步到位。Zhou等利用液液分散微萃取和反相C18柱高效液相色谱紫外检测法测定了茶叶中总硒含量，但是在应用此方法对硒蛋白多糖中总硒含量测定过程中发现，前处理过程中对萃取剂的浓缩会造成4,5-苯并苤硒脑的损失，更重要的一点是普通C18对于4,5-苯并苤硒脑和体系中的干扰物并不能有效分离。发明内容[0003]为了克服现有技术中的问题，本发明提供了高效液相色谱法测定富硒蛋白多糖中总硒含量的方法，快速、环保、简便、精准。[0004]一种高效