一种筛选、识别干细胞的试剂盒及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102796700A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102796700A(43)申请公布日2012.11.28(21)申请号201110149665.5(22)申请日2011.05.25(71)申请人李福生地址213031江苏省常州新北区龙虎塘腾龙苑62幢602室申请人卢磊磊(72)发明人李福生卢磊磊卢淼淼卢晶晶(51)Int.Cl.C12N5/074(2010.01)C12N5/095(2010.01)G01N33/53(2006.01)C12Q1/02(2006.01)A61L27/38(2006.01)A61K35/12(2006.01)A61K35/24(2006.01)A61K35/42(2006.01)权利要求书权利要求书22页页说明书说明书99页页(54)发明名称一种筛选、识别干细胞的试剂盒及其应用(57)摘要本发明涉及一种筛选、识别干细胞的试剂盒及其应用，本发明的试剂盒包括：筛选试剂、细胞洗涤液、识别试剂、细胞因子组合、使用说明书及相应试剂混合容器。试剂盒所述的筛选试剂为化疗药物，识别试剂用于对筛选后的干细胞群和或其子代进行识别，本试剂盒可实现工业化批量生产，使用简便、特异性强、实用有效，可直接用于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的干细胞筛选、识别，具有广泛应用前景。CN102796ACN102796700A权利要求书1/2页1.一种筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)筛选试剂；2)细胞洗涤液；3)识别试剂；4)细胞因子组合；5)描述使用方法的说明书，以及任选的；6)混合容器和装置。其中，所述筛选试剂选择包括抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺的一种或两种以上的组合。其中，所述识别试剂选择BrdU、氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EDU)和其他可标记所述干细胞群或细胞系或其子代的任一分子或物质。2.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述化疗药物的浓度约1mg/kg-100mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间范围为0.1h-72h，或选择使用所述的化疗药物的浓度约10mg/kg-50mg/kg细胞重量，且所述化疗药物作用细胞群的时间范围为0.5h-36h。3.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述识别试剂使用的浓度约0.1mg/kg-15mg/kg细胞重量，所述标记作用于所述筛选后干细胞群的时间为0.01h-96h。4.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述化疗药物选择以抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、抗生素化疗药物、植物化疗药物联合铂类化疗药物任一一种的组合。5.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞洗涤试液可为生理盐水、PBS、或其他缓冲液。6.根据权利要求1所述的筛选、识别干细胞的试剂盒，其特征在于，所述细胞因子选择EGF、B27、bEGF、N2、Heparin、LIF为基础的细胞因子组合，其中所述EGF终浓度为5ng/mL-100ng/mL，优选10ng/mL-50ng/mL，所述bFGF终浓度为5ng/mL-100ng/mL，优选10ng/mL-50ng/mL，所述Heparin终浓度为2μg/mL-40μg/mL，所述B27、N2终浓度分别为2ng/mL-50ng/mL，优选10ng/mL-30ng/mL，所述LIF(白血病抑制因子)终浓度为100U/mL-1500U/mL，优选500U/mL-1000U/mL。7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的标记干细胞携带的标记也可选择为磁性氧化铁标记、量子点标记、GFP标记、RFP标记或其他任何可以让所述筛选的干细胞和或子代携带的标记。8.根据权利要求1至7所述的筛选、识别干细胞试剂盒的使用方法，其使用包括如下步骤：a)细胞预处理：收集经处理后的细胞，台盼蓝染色计算细胞存活率，随后，低温以800～1000g离心3mim～5min，丢弃上清，称重细胞重量。b)混合筛选试剂：通过筛选试剂混合容器进行筛选试剂的混合。c)筛选干细胞：细胞重新接种于培养瓶或培养板或培养皿内按照细胞重量加入一定2CN102796700A权利要求书2/2页浓度的筛选试剂，随后，于37℃，5％CO2条件下培养一定时间再收集细胞，筛选试剂加入次数可以为1～10次。d)计算细胞存活率：收集细胞，低温以800～1000g离心3mim～5min，丢弃上清，加入细胞洗涤液洗涤1～2次，计算细胞存活率后，离心丢弃上清，称重