用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103087979A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103087979103087979A(43)申请公布日2013.05.08(21)申请号201210440089.4(22)申请日2012.10.26(66)本国优先权数据201110347871.72011.10.28CN(71)申请人李福生地址213031江苏省常州新北区龙虎塘腾龙苑62幢602室申请人卢磊磊(72)发明人李福生卢磊磊卢淼淼卢晶晶(51)Int.Cl.C12N5/071(2010.01)C12N5/095(2010.01)权权利要求书3页利要求书3页说明书16页说明书16页附图4页附图4页(54)发明名称用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法(57)摘要本发明涉及一种用于富集、提纯干细胞的方法、试剂盒及其应用方法，本发明所公开的方法、试剂盒可直接用于啮齿动物、人类或其他哺乳动物来源的干细胞富集提纯，采用本发明的方法、试剂盒可有效且精准的用于从所述细胞群中富集、提纯出干细胞，此外，根据本发明所述的方法、试剂盒获得的干细胞还可以不带任何外来标记，所述试剂盒具有使用简捷、可工业化生产、实用有效的优点。本发明还涉及获得干细胞及它们在诸如研究、诊断、药物筛选或治疗中的广泛用途。CN103087979ACN103879ACN103087979A权利要求书1/3页1.用于富集、提纯干细胞的方法，其特征在于：联合化疗药物与凝集素用于从细胞群体中富集、提纯干细胞，所述方法包括：(1)使所述细胞群与至少一种化疗药物进行接触，其可诱导处于细胞周期的细胞凋亡；(2)再使所述细胞群与凝集素结合物进行接触，后者含有：至少一种凝集素，其可与所述细胞上的受体结合，随后将凝集素结合的细胞群与剩余细胞样品分离；通过上述负向和正向选择，从而实现从所述细胞群体中富集、提纯出干细胞，获得富含干细胞的细胞样品。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括在所述细胞群与化疗药物接触之前进行细胞预处理所述细胞群体。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，细胞预处理过程选择采用沉淀或裂解法沉淀或裂解细胞群中的红细胞的试剂，所述试剂可选择为质量浓度为0.1～20％的羟乙基淀粉、明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羧甲基淀粉的任一一种；或可选择为氯化铵红细胞裂解液、质量浓度小于0.9％的生理盐水溶液的任一一种；或选择泛影酸钠-葡聚糖、HITOPAQUE、Ficoll的任一一种，所述试剂至少重复接触所述细胞群一次。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述化疗药物包括但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、门冬酰胺酶、甲基苄肼、草酸铂、铂类、丙亚胺、羟基脲和氨烯咪胺及其衍生物的一种或两种以上的组合，所述化疗药物接触所述细胞群的时间小于或等于168小时。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝集素和或凝集素结合物中的凝集素包括天然的或化学合成的植物凝集素、动物凝集素或其衍生物的一种或两种以上的组合，所述凝集素的浓度为0.001～50mg/ml，与所述细胞群接触的时间为小于或等于150分钟，孵育温度为小于或等于38℃。6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述凝集素结合物中的结合物可选择预先与荧光染料、磁性微球或高分子量的生物大分子的任一一种进行结合，或选择具有对凝集素有亲和力抗体或抗体衍生物或抗体片段的一种。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述与凝集素结合的高分子量的生物大分子的分子量在一万道尔顿(Mw)至五十万道尔顿(Mw)之间，其中所述高分子量的生物大分子可选择为牛血清白蛋白、羟乙基淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基淀粉、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮的任一一种。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含干细胞的细胞群来源于啮齿动物、人类或其他哺乳动物的胚胎组织、成体组织、肿瘤/癌前组织、肿瘤/癌性组织、转移瘤/癌组织或其他潜在包含干细胞的一种或两种以上组织的组合，或选择来自所述组织的原代、传代细胞群的一种或两种以上的组合。9.联合化疗药物与凝集素用于富集、提纯干细胞的试剂盒及其应用方法，其在用于从所述细胞群中富集、提纯干细胞的用途。10.根据权利要求9所述的用于富集、提纯干细胞的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：2CN103087979A权利要求书2/3页1)细胞负向选择试剂A；2)细胞正向选择试剂B；3)以及任选的容器；其中，细胞负向选择试剂A为化疗药物，包含但不限于抗生素化疗药物、抗代谢化疗药物、烷化剂化疗药物、激素及内分泌化疗药物、植物化疗药物、亚硝脲类化疗药物、抗体阻断剂化疗药物、