一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102552926A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102552926A(43)申请公布日2012.07.11(21)申请号201110454297.5(22)申请日2011.12.30(71)申请人史占军地址510515广东省广州市广州大道北1838号申请人王健(72)发明人史占军王健(74)专利代理机构广州中瀚专利商标事务所44239代理人黄洋盖军(51)Int.Cl.A61K47/42(2006.01)C07K7/06(2006.01)A61P35/00(2006.01)权利要求书权利要求书1页1页说明书说明书44页页附图附图33页(54)发明名称一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法(57)摘要本发明的目的是提出一种骨肉瘤化疗药物载体及获得该载体的方法，为骨肉瘤的治疗及其他肿瘤相应载体的获得提供技术参考。本发明的骨肉瘤化疗药物作用载体是与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合载体，其构成氨基酸包括：TKPDKGY。本发明首先采用噬菌体展示技术，以荷瘤裸鼠模型为实验对象，经过多轮筛选成功获得了氨基酸序列为TKPDKGY的短肽。体外合成该载体与肿瘤抑素活性片段复合物，用于骨肉瘤治疗研究表明，相对于对照组，载体-药物复合物有较好的治疗效果，说明该载体具备良好的结合性、特异性及靶向性，可以成为骨肉瘤化疗药物载体。CN102596ACN102552926A权利要求书1/1页1.一种骨肉瘤化疗药物作用载体，其特征在于：该骨肉瘤化疗药物作用载体是与骨肉瘤血管内皮细胞特异性结合载体，其构成氨基酸包括：TKPDKGY。2.根据权利要求1所述的骨肉瘤化疗药物作用载体的获得方法，其特征在于包括以下步骤：A：在骨肉瘤荷瘤裸鼠的尾静脉注射噬菌体，体内循环10分钟，待骨肉瘤荷瘤裸鼠麻醉后，处死骨肉瘤荷瘤裸鼠，取肿瘤组织液氮速冻后，匀浆化处理，获得洗脱液；B：取洗脱液加入对数期ER2738菌液中，在室温条件下与组织静止感染并温育至少30分钟；C：取少量感染后的菌液测滴度，计算总产出量，剩余感染菌液加入培养基及对数期菌液中，扩增与骨肉瘤血管内皮特异性结合噬菌体；D：利用经典PEG/NaCl法沉淀扩增后的噬菌体，制备噬菌体扩增液，利用经典方法测定噬菌体滴度；E：若步骤D中的噬菌体滴度未达标，则重复C、D步骤进行下一轮筛选；若步骤D中噬菌体滴度达标，则电泳鉴定噬菌体是否存在插入片段，并测序获得靶向性及稳定性最好的噬菌体克隆，推导出其氨基酸序列，得到骨肉瘤化疗药物作用载体。2CN102552926A说明书1/4页一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法技术领域[0001]本发明涉及一种骨肉瘤化疗药物载体及其获得方法。背景技术[0002]骨肉瘤是最为常见的恶性骨肿瘤，其发病率占原发恶性骨肿瘤的22.36%，80～90%的病人在确诊时已发生体内其它部位的转移。目前超大剂量化疗仍是骨肉瘤最主要的治疗方法之一，但化疗的同时也会对机体正常组织产生严重的毒性作用。因此，增强化疗药物针对骨肉瘤组织的靶向性，成为目前急待解决的一个课题。[0003]肿瘤的血管生成是肿瘤发展的重要环节，肿瘤必须通过形成新的血管系统来提供足够的营养，以支持其继续生长，因此将肿瘤新生血管内皮上的某些特异性分子作为药物作用的新靶点,日益受到研究者的密切关注。为了获取能与上述靶点特异性结合的配体,必须具备有效的筛选手段。噬菌体展示技术的应用为实现此目的提供了一个全新的工具。[0004]噬菌体展示技术是20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术，其原理是将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在噬菌体的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该噬菌体内。噬菌体展示技术的一个最基本的特征是将表现型和基因型有效联系起来，即噬菌体表面的特定表现型与噬菌体颗粒中的基因型信息相对应，如需得到某个特定的表现型，只需在噬菌体基因组中插入该表现型的相关基因即可。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序是将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合的噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。将被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。经3～4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面的研究，包括绘制抗原表位图谱、研究蛋白质-蛋白质相互作用和鉴定非肽配体的肽模拟物等。[0005]Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白（pIII）上而构建成的一个组合文库。所展示的随机多肽两侧各